Manipolazione CRISPR mirata alla placenta del mouse in vivo

La placenta è un organo essenziale coinvolto nello sviluppo del feto. Il ruolo principale della placenta è quello di fornire fattori essenziali e regolare il trasferimento di nutrienti e rifiuti da e verso il feto. Le placente dei mammiferi sono composte da tessuto fetale e materno, che costituiscono l’interfaccia fetale-materna e, quindi, la genetica della madre e del feto influisce sulla funzione¹. Anomalie genetiche o compromissione della funzione della placenta possono alterare drasticamente lo sviluppo fetale. Lavori precedenti hanno dimostrato che la genetica e lo sviluppo placentare sono associati allo sviluppo alterato di specifici sistemi di organi nel feto. In particolare, le anomalie nella placenta sono legate a cambiamenti nel cervello fetale, nel cuore e nel sistema vascolare 2,3,4,5.

Il trasporto di ormoni, fattori di crescita e altre molecole dalla placenta al feto svolge un ruolo importante nello sviluppo fetale⁶. È stato dimostrato che alterare la produzione placentare di molecole specifiche può alterare lo sviluppo neurologico. L’infiammazione materna può aumentare la produzione di serotonina alterando l’espressione genica metabolica del triptofano (TRP) nella placenta, che successivamente crea un accumulo di serotonina nel cervello fetale⁷. Altri studi hanno trovato anomalie placentari accanto a difetti cardiaci. Si ritiene che le anomalie nella placenta contribuiscano a difetti cardiaci congeniti, il difetto alla nascita più comune negli esseri umani⁸. Uno studio recente ha identificato diversi geni che hanno percorsi cellulari simili sia nella placenta che nel cuore. Se interrotti, questi percorsi potrebbero causare difetti in entrambi gli organi⁹. I difetti nella placenta possono esacerbare i difetti cardiaci congeniti. Il ruolo della genetica e della funzione placentare sullo sviluppo di specifici sistemi di organi fetali è un campo di studio emergente.

I topi hanno placente emocoriali e altre caratteristiche delle placente umane, il che li rende modelli molto utili per lo studio delle malattie umane¹. Nonostante l’importanza della placenta, attualmente mancano manipolazioni genetiche mirate in vivo. Inoltre, ci sono attualmente più opzioni disponibili per knockout o knockdown rispetto alla sovraespressione o alle manipolazioni di guadagno di funzione nella placenta¹⁰. Esistono diverse linee transgeniche che esprimono il Cre per la manipolazione placentare-specifica, ognuna in diversi lignaggi di trofoblasti in diversi punti temporali. Questi includono Cyp19-Cre, Ada/Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER, e Gcm1-Cre 11,12,13,14. Mentre questi transgeni Cre sono efficienti, potrebbero non essere in grado di manipolare alcuni geni in punti temporali specifici. Un altro metodo comunemente usato per eliminare o sovraesprimere l’espressione genica placentare è l’inserimento di vettori lentivirali nella coltura di blastocisti, che causa una manipolazione genetica specifica del trofoblasto^15,16. Questa tecnica consente un robusto cambiamento nell’espressione genica placentare nelle prime fasi dello sviluppo. L’uso dell’interferenza dell’RNA in vivo è stato scarsamente utilizzato nella placenta. L’inserimento di plasmidi shRNA può essere eseguito in modo simile alla tecnica CRIPSR descritta in questo articolo. Questo è stato fatto a E13.5 per ridurre con successo l’espressione di PlGF nella placenta, con impatti sulla vascolarizzazione cerebrale della prole¹⁷.

Oltre alle tecniche utilizzate principalmente per knockout o knockdown, l’induzione della sovraespressione viene comunemente eseguita con adenovirus o l’inserimento di una proteina esogena. Le tecniche utilizzate per la sovraespressione hanno tassi variabili di successo e sono state per lo più eseguite più tardi nella gestazione. Per studiare il ruolo del fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) nella funzione placentare, è stato eseguito un trasferimento genico placentare adenovirale-mediato per indurre la sovraespressione del gene IGF-1 ^18,19. Questo è stato eseguito tardi nella gestazione del topo su E18.5 tramite iniezione placentare diretta. Per fornire ulteriori opzioni e aggirare possibili fallimenti di manipolazioni genetiche placentari stabilite, come i fallimenti della combinazione Cre-Lox, la possibile tossicità degli adenovirus e gli effetti off-target dello shRNA, è possibile utilizzare la manipolazione diretta CRISPR in vivo della placenta^20,21,22. Questo modello è stato sviluppato per ovviare alla mancanza di modelli di sovraespressione e per creare un modello con flessibilità.

Questa tecnica si basa sul lavoro di Lecuyer et al., in cui i plasmidi shRNA e CRISPR sono stati mirati direttamente in vivo alle placente di topo per alterare l’espressione di PlGF ¹⁷. Questa tecnica può essere utilizzata per alterare direttamente l’espressione genica placentare utilizzando la manipolazione CRISPR in più punti temporali; per questo lavoro è stato selezionato E12.5. La placenta è maturata a questo punto ed è abbastanza grande da manipolare, consentendo l’inserimento di uno specifico plasmide CRISPR su E12.5, che può avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale da metà a fine gravidanza^23,24. A differenza degli approcci transgenici, ma simile alle induzioni virali o all’interferenza dell’RNA, questa tecnica consente la sovraespressione o il knockout in particolari punti temporali utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, evitando così possibili compromissione della placentazione o letalità embrionale da cambiamenti precedenti. Poiché solo poche placente ricevono il plasmide sperimentale o di controllo all’interno di una cucciolata, l’approccio consente due tipi di controlli interni. Questi controlli sono quelli iniettati ed elettroporati con il plasmide di controllo appropriato e quelli che non ricevono alcuna manipolazione diretta. Questa tecnica è stata ottimizzata per creare una sovraespressione del gene IGF-1 nella placenta del topo tramite un plasmide CRISPR mediatore di attivazione sinergica (SAM). È stato scelto il gene IGF-1, poiché IGF-1 è un ormone della crescita essenziale consegnato al feto che viene prodotto principalmente nella placenta prima della nascita^25,26. Questa nuova tecnica CRISPR mirata alla placenta consentirà la manipolazione diretta per aiutare a definire la connessione tra la funzione placentare e lo sviluppo fetale.