İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

Bu protokol, sağlıklı donör kaynaklı CD34 + HSPC’lerin kullanılmasını gerektirir ve yerel kurumsal inceleme kurullarından (IRB) etik onay ve imzalı bilgilendirilmiş onam gerektirir. Bu protokolde kullanılan CD34 + HSPC’ler, term doğumların göbek kordon kanından (UCB) izole edildi (>34 gebelik haftası). Doğumdan önce annelerden bilgilendirilmiş onam alındı ve UCB’nin toplanması için etik onay (IRB onayı: 31-322 ex 18/19) Graz Tıp Üniversitesi’nden alındı. Bu protokolde kullanılan malzemelerin tam listesi Malzeme Tablosunda bulunabilir. 1. sgRNA tasarımı ve kesme verimliliklerinin değerlendirilmesi İstenilen mutasyonun yerini ve doğru transkripti çevrimiçi bir veritabanı aracında arayın (örneğin, COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Bir sgRNA tasarım aracı kullanarak mutasyona bitişik (ekzonik hedefleme) veya önceki intronda (intronik hedefleme) bir sgRNA seçin. Bu protokolde, Benchling’in çevrimiçi aracı kullanılır. sgRNA tasarımı için olası çevrimiçi araçların bir listesi için Malzeme Tablosu’na bakın. DNA Dizisi > DNA Dizilerini İçe Aktar > Veritabanlarından İçe Aktar > + (oluştur) seçeneğini belirleyin. İstediğiniz geni girin, örneğin CALR ve tür olarak insanı seçin > Arama > Doğru transkripti seçin (örneğin, CALR-201 -ENST00000316448) > İçe Aktarma. DS molasının tanıtılacağı ilgi alanını seçin (örneğin, intron 7). Ekranın sağ tarafındaki CRISPR seçeneğini belirleyin ve Kılavuzları tasarla ve analiz et’i seçin. Tek kılavuz seçin, kılavuz uzunluğunu 20 bp’ye ve SpCas9 (NGG) ile düzenlemek için PAM sırasına göre tutun. Yüksek hedef içi puana (istenen lokusta düzenleme yapma şansı yüksek) ve yüksek hedef dışı puana (istenmeyen lokuslarda düşük düzenleme şansı) sahip bir kılavuz seçin. En iyi performans gösteren sgRNA’yı bulmak için test etmek üzere en az üç kılavuz seçin. SgRNA’yı ticari bir satıcıdan kimyasal olarak modifiye edilmiş sentetik bir sgRNA olarak sipariş edin.NOT: Bu aşamada, ilk elek için az miktarda sentetik sgRNA sipariş etmeniz önerilir. İyi performans gösteren bir sgRNA tanımlandıktan sonra, seçilen sgRNA’nın daha büyük bir sırası ile devam edin. Çözme 2 x 10 5-5 x 105 CD34 + HSPC’ler. Hücreleri% 1 antibiyotik (örneğin, penisilin / streptomisin) ile desteklenmiş 10 mL önceden ısıtılmış RPMI1640’a aktarın.NOT: En iyi ve en tekrarlanabilir sonuçları elde etmek için %>90 saflıkta CD34+ HSPC’ler kullanılmalıdır. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) 350 x g’da santrifüj. Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve% 0.2 penisilin / streptomisin (P / S), 100 ng / mL trombopoietin (TPO), 100 ng / mL kök hücre faktörü (SCF), 100 ng / mL FMS benzeri tirozin kinaz 3 ligand (FLT3L), 100 ng / mL interlökin-6 (IL-6), 35 nM UM171 ve 0.75 μM StemRegenin1 (SR1) ile desteklenmiş SFEM II ortamındaki hücreleri 2.5 x 105 hücre / mL konsantrasyonuna kadar askıya alın. 48 saat -72 saat boyunca 37 °C / %5 CO 2’de inkübe edin.NOT: Ortamın tamamı bundan böyle HSPC saklama ortamı olarak anılacaktır. Hücreleri 15 mL’lik bir tüpte toplayın ve hücreleri sayın. Tripan mavisi dışlama ile hücre canlılığını kontrol edin.Başlamadan önce, transfeksiyon sistemini açın ve küvet seçeneğini seçin. HSPC’ler için uygun programı ve nükleofeksiyon çözümünü seçin (bkz. 2 x 10 5 ile5 x 10 arasında6 hücre bir 100 μL küvette çekirdeklendirilebilir. WT kontrolü olarak kullanılmak üzere 48 saat boyunca kültürde tutmak için az sayıda hücreyi (örneğin, 1 x 105-2 x 105) bir kenara koyun. RNP kompleksini hazırlayın. 1,5 mL’lik bir tüpte, 15 μg Cas9 ve 8 μg sgRNA (molar oran 1: 2.5) ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca 25 ° C’de inkübe edin. RNP kompleksi inkübe edilirken, hücreleri RT’de 350 x g’de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve bir pipet kullanarak süpernatantı atın. Hücreleri 100 μL nükleofeksiyon çözeltisi içinde askıya alın. Hücreleri RNP kompleksi ile karıştırın ve küvete aktarın. Transfer sırasında oluşmuş olabilecek olası hava kabarcıklarını çıkarmak için küvete hafifçe dokunun. Küvetin transfeksiyon sisteminin tutucusuna yerleştirilmesi ve DZ-100 programı ile hücrelerin elektroporasyonu yapılır. Elektroporasyondan hemen sonra, P/S olmadan 400 μL önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı ekleyin. İnce transfer pipetine sahip hücreleri, P/S olmadan önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı içeren bir kültür plakasına aktarın. hücre numarasına bağlı olarak, 0,25 x 10 6 ile 1 x 106 hücre/mL arasında bir yoğunluğa ulaşmak için uygun bir kültür plakası (24-, 12- veya6-well plate) kullanın. Plakayı inkübatöre 37 °C / % 5 CO2’de aktarın. Çekirdeklenmiş hücreleri 6-8 saat boyunca inkübe edin. 6-8 saat sonra, eski ortamı çıkarın ve P / S ile desteklenmiş taze önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı ile değiştirin. hücreleri 2.5 x 10 5 ile5 x 105 arasındaki bir konsantrasyonda askıya alın ve bir hücre kültürü plakasına (24-, 12 veya 6 delikli plaka) aktarın. Hücreleri 37 ° C / % 5 CO 2’de 48 saat boyuncainkübe edin. 2 x 10 5 hücre hasat edin veRT’de 5 dakika boyunca 350 x g’de santrifüj yapın. Başlamadan önce, ısıtma bloklarını 65 ° C ve 98 ° C’ye ayarlayın. Süpernatantı atın ve hücreleri 1,5 mL’lik bir tüpte 1 mL’lik 1x DPBS’de askıya alın. RT’de 5 dakika boyunca 350 x g’de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücreleri 50 μL DNA ekstraksiyon çözeltisinde askıya alın. 15 s. için vorteks. 65 °C’de 6 dakika boyunca inkübe edin. 15 s vorteks ve 98 ° C’de 2 dakika kuluçkaya yatırın. DSB bölgesini, merkezdeki DSB ile yaklaşık 400-600 bp’lik bir amplikon üreten primerleri kullanarak PCR ile yükseltin. PCR reaksiyonu için 0.5-1 μL ekstrakte edilmiş DNA kullanın.NOT: DNA ekstraksiyon çözeltisinin bileşimi nedeniyle, DNA konsantrasyonları spektrofotometri ile doğru bir şekilde ölçülemez. PCR ürününü DNA merdiveni ile 100 V’ta 100 V’ta % 1,5’lik agaroz jeli üzerinde 45-60 dakika boyunca çalıştırın. Jeli mavi bir ışık veya UV transilluminator üzerine yerleştirin. Üreticinin talimatlarına göre piyasada satılan bir kit kullanarak jelden doğru boyuttaki DNA bandını çıkarın (bkz. PCR’den ileri astar veya ters primer kullanarak numuneleri Sanger dizilimi ile sıralayın. 400-600 bp uzunluğundaki PCR ürünleri için, toplam 15 μL hacimde 5 ng / mL’lik bir konsantrasyonla dizileme için 75 ng DNA gereklidir. Sıralama dosyalarını, sgRNA tarafından üretilen ekleme ve silme işlemlerini tanımlayarak düzenleme verimliliğini hesaplamak için tasarlanmış bir programa yükleyerek sgRNA’ların düzenleme verimliliğini analiz edin. Devam etmek için en iyi performans gösteren sgRNA’yı seçin.NOT: Özel çevrimiçi araçlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Bu analiz, transfekte edilmiş ve WT HSPC’lerin .ab1 dosyalarını, sgRNA dizisini ve PAM dizisini gerektirir. 2. Homolojiye yönelik onarım (HDR) vektör yapısı HDR şablon tasarımıNOT: İki HDR şablonu tasarlanmalıdır: WT dizisi için bir şablon ve mutasyona uğramış dizi için bir şablon.İstenilen genin genomik dizisini ve kodlama dizisini (CDS) moleküler klonlama için uygun bir yazılıma aktarın ( özel araçlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir). Genomik dizi dosyasından, DSB’nin 5′ ucunda ideal olarak 400 bp seçerek sol homoloji kolunu (HA) tasarlayın. Bu sırayı yeni bir dosyaya yapıştırın. Bir intron sgRNA ile hedeflenirse, bir ekleme alıcısı (SA) dizisinin dahil edilmesi gerekir. Hedeflenen intron’un son 150 bp’sini seçin ve sol HA’dan sonra yapıştırın. Ekzon doğrudan hedeflenmişse, bu dizi gerekli değildir (Şekil 3). CDS dosyasından, ilgilendiğiniz cDNA’yı seçin. Bir ekzonik dizinin hedeflenmesi durumunda, cDNA’nın DSB bölgesinin hemen aşağısında başladığından ve ilgili genin aşağıdaki ekzonlarını ve durdurma kodonunu içerdiğinden emin olun. Bir intron hedeflenirse, cDNA’nın aşağıdaki ekzonun ilk kodonu ile başladığından emin olun. cDNA’yı kodon ile optimize edin ve SA dizisinden sonra yerleştirin. Bu amaçla özel çevrimiçi araçlar kullanın (Malzeme Tablosu). İlgilenilen cDNA’dan sonra 3′ poliadenilasyon (PolyA) sinyali ekleyin (örneğin, SV40 veya bGH) (Tablo 1). PolyA’yı takiben, floresan protein için bir promotör dizisi (örneğin, dalak odağı oluşturan virüs [SFFV] veya poliubikitin C [UBC], Tablo 1) ekleyin. Floresan proteini için diziyi ekleyin (yani, GFP, BFP veya mCherry). İkinci fakat farklı bir PolyA sinyali ekleyin.NOT: Farklı bir PolyA dizisinin eklenmesi, plazmidin bakteriyel rekombinasyonu veya şablondaki iki özdeş dizi nedeniyle dizi hizalaması ile ilgili sorunlar gibi sorunları önleyecektir. Genomik dizi dosyasından, DSB’nin 3′ ucunda ideal olarak 400 bp seçerek doğru HA’yı tasarlayın. Bu sırayı ikinci PolyA’dan sonra ekleyin. Tüm kalıbın bir kopyasını oluşturun ve istenen mutasyonun dizisini içerecek şekilde ilgili cDNA’yı değiştirin. Floresan proteinini farklı bir floresan proteini ile değiştirin. Örneğin, WT şablonu için GFP kullanılmışsa, mutant şablon için BFP veya mCherry ile değiştirin. HDR şablonlarını oluşturun ve pAAV-MCS plazmidine (veya diğer uygun omurgalara) klonlayın.NOT: Montaj için gerekli parçalar PCR ile üretilebilir veya ticari olarak sipariş edilebilir ve komşu parçalarıyla örtüşen diziler içermesi gerekir. İlgilenilen mutasyon bir nokta mutasyonu, küçük bir ekleme veya küçük bir silme ise, mutasyona uğramış cDNA, WT cDNA’yı içeren HDR şablonunda bölgeye yönelik bir mutagenez gerçekleştirilerek PCR tarafından üretilebilir. Isı şoku yöntemini kullanarak yetkin Escherichia coli’yi monte edilmiş ürünle dönüştürün. Başlamadan önce, bakterileri 10 dakika boyunca buz üzerinde çözülmesi için yerleştirin. Toplanan ürünlerden 2 μL’yi 50 μL bakteriye ekleyin. İçeriği hafifçe hafifçe vurarak karıştırın. Örnekleri 30 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Numuneleri 30 s için 42 °C’ye ayarlanmış bir termobloğa aktarın. Numuneleri 5 dakika boyunca buz üzerinde aktarın. 450 μL oda sıcaklığında SOC ortamı ekleyin ve numuneleri 1 saat boyunca 37 °C’de inkübe edin. Numuneleri ampisilin içeren LB agar plakalarına yayın. Her numune için, toplanabilen tek kolonili LB agar plakaları elde etmek için bakteri çözeltisinin üç farklı seyreltisinden (seyreltilmemiş, 1: 5 ve 1: 10) 100 μL’lik bir miktar yayın. Plakaları gece boyunca 37 ° C’de inkübe edin. Ertesi gün, numune başına üç koloni seçin. Kolonileri, ampisilin ile desteklenmiş 4 mL LB ortamı içeren kapaklı 15 mL tüplere aktarın ve gece boyunca 37 ° C’de bir çalkalayıcıda inkübe edin. Her koloniden gelen bakteriyel çözeltinin Aliquot 500 μL’si ve daha sonra kullanmak üzere buzdolabında saklayın. Plazmid DNA’sını üreticinin talimatlarına göre çıkarmak için mini bir hazırlık yapın. Plazmidlerin doğru şekilde monte edildiğini onaylamak için örnekleri Sanger dizilemesi için gönderin. Kesintisiz dizi onayı sağlamak için plazmid boyunca dağılmış yeterli sayıda primer kullanın, ideal olarak her bölgeyi ileri ve geri okumalarla iki kez kaplayın. Doğru şekilde monte edilmiş plazmidi içeren bakteriyel çözeltinin 200 μL’sini, ampisilin ile desteklenmiş 200 mL LB ortamına ekleyin ve 37 ° C’de gece boyunca bir çalkalayıcıda inkübe edin. Plazmid DNA’sını üreticinin talimatlarına göre çıkarmak için bir midi veya maxi hazırlığı gerçekleştirin. Plazmid DNA’sını -20 °C’de saklayın. Rekombinant AAV6 preparatıNOT: İki ayrı AAV6 hazırlığının gerçekleştirilmesi gerekecektir: biri WT HDR şablonuna sahip rAAV6 için, diğeri mutasyona uğramış HDR şablonuna sahip rAAV6 için. Bu bölümde, yalnızca bir virüsün hazırlanması için gereken adımlar açıklanmaktadır.HEK293T hücrelerini çözün, hücreleri% 10 FBS,% 1 P / S ve 25 mM HEPES ile desteklenmiş 10 mL önceden ısıtılmış DMEM’e aktarın ve 5 dakika boyunca RT’de 350 x g’de santrifüj yapın. Hücreleri 1 x 105 hücre / mL konsantrasyonda askıya alın ve uygun bir şişeye (örneğin, 175cm2’lik bir şişe) aktarın. Şişeyi 37 °C / % 5 CO2’de bir inkübatöre aktarın.NOT: HEK293T hücreleri, hücrelerin tamamen iyileşmesini ve yeterli sayıda hücre elde etmesini sağlamak için önceden çözülmelidir (bir virüsün üretimi için 11 x 107 hücre gereklidir). Hücrelerin en az üç pasajdan sonra kullanılması ve hücrelerin 20 pasajın altında tutulması önerilir. HEK293T hücreleri haftada üç kez bölünmelidir. Hücreleri korurken, bunlar% 70-80 akıcılığı geçmemelidir. AAV preparatında kullanılan DMEM ayrıca L-glutamin ve sodyum piruvat ile desteklenmelidir. Hücreleri 50 mL’lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca RT’de 350 x g’de santrifüj yapın. Hücreleri% 10 FBS,% 1 P / S ve 25 mM HEPES ile desteklenmiş 20 mL DMEM’de askıya alın ve bir hemositometre ile sayın. Ölü hücre dışlaması için tripan mavisi kullanın. 175 cm2’lik bir şişede FBS, %1 P/S ve 25 mM HEPES ile desteklenmiş 20 mL DMEM’de tohum 3 x 106 hücre. Bir virüsün üretimi için en az dört adet 175cm2 şişe hazırlayın. Hücreleri 3 gün boyunca 37 °C / % 5 CO2’de inkübe edin.NOT: Bu adım, hücrelerin hafta sonu boyunca genişlemesine izin verdiği için en iyi Cuma günü gerçekleştirilir. HEK293T hücrelerini toplayın ve sayın. Virüslerden birinin hazırlanması için, her biri% 10 FBS,% 1 P / S ve 25 mM HEPES ile desteklenmiş 20 mL DMEM’de 11 x 106 HEK293T içeren on adet 150 mm’lik tabak hazırlayın. Bulaşıkları inkübatöre 24 saat boyunca 37 °C / % 5 CO2’ye yerleştirin. Eski ortamı dikkatlice atın ve% 10 FBS, 25 mM HEPES ve 1 mM sodyum bütirat ile desteklenmiş 20 mL antibiyotiksiz DMEM ile değiştirin. Devam etmeden önce, hücrelerin akıcılığının% 80’in üzerinde olmadığını kontrol edin. Transfeksiyon karışımlarını içerecek iki adet 15 mL tüp hazırlayın. Tüp 1’e 5 mL azaltılmış serum ortamı, 60 μg rAAV6 mutasyona uğramış HDR plazmid ve 220 μg pDGM6 (yardımcı plazmid) ekleyin. Tüp 2’ye, 5 mL indirgenmiş serum ortamı ve 1120 μL 1 mg / mL polietilenimin çözeltisi (PEI, transfeksiyon reaktifi) ekleyin. Tüp 2’nin içeriğini Tüp 1’e ekleyin ve 30 saniye boyunca vorteks. DNA’nın PEI misellerine uygun şekilde kapsüllenmesini sağlamak için RT’de 15 dakika boyunca inkübe edin.NOT: Çözeltiyi 20 dakikadan fazla tutmayın. Her bir kaba damla damla 1.1 mL çözelti dikkatlice ekleyin ve yavaşça döndürerek dağıtın. Bulaşıkları inkübatöre 48 saat boyunca 37 °C / % 5 CO2’ye yerleştirin. 48 saat sonra, her yemeğe 250 μL 0,5 M EDTA ekleyin ve bulaşıkları 10 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Hücreleri tabakta yıkayarak toplayın ve 500 mL’lik bir santrifüj tüpüne veya birden fazla 50 mL’lik tüpe aktarın. 4 °C’de 10 dakika boyunca 2.000 x g’de santrifüj. Süper natantı atın. Süpernatanın tamamen çıkarılmasını sağlamak için, 4 ° C’de 1 dakika boyunca 2.000 x g’de tekrar santrifüj yapın. Kalan süpernatan olanları atın. Herhangi bir artık süpernatant, virüsün saflaştırılmasını bozabilir. Peleti vorteks yaparak gevşetin ve üreticinin talimatlarına göre bir AAV saflaştırma kiti kullanarak virüsü çıkarın (Malzeme Tablosuna bakınız). Alternatif olarak, iyodiksanol gradyanı ultrasantrifüjleme30,31 ile ekstraksiyon gerçekleştirin. Saflaştırılmış virüsü Aliquot ve -80 ° C’de saklayın. Optimal transdüksiyon koşullarını belirlemek için AAV’yi işlevsel olarak titre edin veya AAV titresini dijital damlacık PCR (ddPCR)32 ile ölçün. rAAV6 WT HDR plazmidinin hazırlanması için bu işlemi tekrarlayın. ddPCR ile AAV titrasyonuBaşlamadan önce, ısıtma bloklarını 65 ° C ve 98 ° C’ye ayarlayın. Virüsün 5 μL’sine 15 μL DNA ekstraksiyon çözeltisi ekleyerek viral DNA’yı çıkarın. 15 s. için vorteks. 65 °C’de 6 dakika boyunca inkübe edin. 15 s. için vorteks. 98 °C’de 2 dakika kuluçkaya yatırın. ddPCR için nükleaz içermeyen (nf) H2O ile seri seyreltmeleri (1:400, 1:40.000, 1:160.000, 1:640.000) hazırlamak için ekstrakte edilmiş DNA’yı (viral DNA’nın 1:4 seyreltilmesidir) kullanın.NOT: ddPCR hemen gerçekleştirilmeyecekse, seyreltmeler -20 ° C’de saklanabilir. ddPCR için seyreltmelerden üçünü seçin. Kullanılacak seyreltmenin seçimi, virüsün konsantrasyonuna bağlıdır. Tercihen, makinenin algılama sınırı içindeki en iyi seyreltmeyi bulmak için üç farklı seyreltme (örneğin, 1:40.000, 1:160.000 ve 1:640.000) kullanın. Çalışırken reaktifleri buz üzerinde tutun. Bir ana karışım hazırlayın (tüm numuneler kopyalar halinde ölçülecektir). Her reaksiyon için aşağıdakileri hazırlayın: Problar için 12,5 μL ddPCR Supermix, dUTP yok, 1,25 μL PrimeTime Std qPCR Testi, AAV-ITR (bkz. Malzeme Tablosu) ve 6,25 μL nf-H2O. 5 μL DNA’yı 20 μL ana karışımla karıştırın. Bunu 1:40.000, 1:160.000 ve 1:640.000 seyreltmeler için gerçekleştirin. Kartuş tutucusuna bir kartuş yerleştirin. Yağ olarak adlandırılan sıradaki problara 70 μL damlacık üretim yağı ekleyin. Herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Örnek olarak adlandırılan satıra örnek hacminin 20 μL’sini ekleyin. Herhangi bir kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Kartuşu contayla kapatın ve damlacık jeneratörüne yerleştirin. Makinedeki başlat düğmesine basarak damlacıkları üretin, contayı çıkarın ve çok kanallı bir pipetle üretilen damlacıkların 40 μL’sini 96 delikli bir plakaya dikkatlice aktarın. Damlacıkların ve hava kabarcıklarının tahrip olmasını önlemek için yavaşça çalışın. PCR plaka sızdırmazlık elemanını kullanarak 96 delikli plakayı delici folyo (yukarı bakan kırmızı şerit) ile kapatın. Plakayı bir termosikletçiye yerleştirin. Ses seviyesini 40 μL’ye, kapak sıcaklığını 105 °C’ye ve rampa hızlarını 2 °C/s’ye ayarlayın. PCR programını Tablo 2’de açıklandığı gibi çalıştırın. Damlacık okuyucuyu kullanmadan 30 dakika önce açın. Yazılımı masaüstünde açın. Plaka düzenini girin ve deneme sekmesinde ABS’yi ve Supermix sekmesinde ddPCR Supermix’i seçin. Ardından, önce PRIME’ye basın, ardından sistemi başlatmak için yazılımdaki FLUSH SYSTEM’e tıklayın. Plakayı okuyucuya girin. Çalıştırmayı başlatın ve tamamlandığında, verileri elektronik tablo olarak sonraki analizler için CSV dosyası olarak dışa aktarın.NOT: Yazılım tarafından üretilen sayılar, μL başına genom kopyalarıdır (GC). Bunların seyreltme faktörleri ile çarpılması gerekir: GC / μL x 5 (ana karışımdaki DNA’nın seyreltilmesi) x ilk seyreltme (yani, 40.000 veya 160.000). Şekil 3: CRISPR/Cas9 HDR knock-in sırasında intronic ve ekzonik hedeflemeye şematik genel bakış. CRISPR/Cas9 HDR knock-in için intronic ve ekzonik hedefleme stratejileri arasında şematik karşılaştırma. (A) İntronik hedefleme sırasında, DNA’nın bir intronunda çift sarmallı bir kırılma meydana gelir. HDR şablonu bir LHA, cDNA dizisi ve RHA’dan oluşur. İntronik hedefleme, ek olarak, 3′ ekleme bölgesini, dal noktasını ve polipirimidin sistemini içeren bir dilim alıcısının varlığını gerektirir. Bu, doğru eklemeyi sağlar. Yeşil noktalı kutu, SA dizisine karşılık gelen bölgeyi temsil eder. SA’nın boyutu 150 bp’dir. (B) Ekzonik hedefleme, doğrudan ekzonda çift sarmallı bir kırılmanın üretilmesine dayanır. HDR şablonu bir LHA, cDNA dizisi ve RHA’dan oluşur. Turuncu noktalı kutular, LHA ve RHA’ya karşılık gelen bölgeleri gösterir. HA’ların ideal boyutu her biri 400 bp’dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Organizatör Ad Uzunluk Tarif cesaret 492 bg Dalak Odağı Oluşturan Virüs destekleyicisi. Güçlü memeli destekçisi. Yapısal olarak ifade edilir UBC 400 bg İnsan ubikitin C geninden türetilen promotör. Yapısal olarak ifade edildi. cesaret 508 bg Sitomegalovirüsten türetilen promotör. Arttırıcı bir bölge içerebilir. Yapısal olarak ifade edildi. Güçlü memeli destekçisi. Susturulabilir. EF-1a 1182 bg İnsan ökaryotik translasyon uzama faktörü 1 alfa promotörü. Yapısal olarak ifade edildi. Güçlü memeli destekçisi. EFS 200-300 bp EF-1 alfa intronsuz kısa form cesaret 584 bg CMV erken arttırıcı (C), tavuk beta aktin promotörü (A) ve tavşan beta-globin geni (G) için ek alıcı içeren hibrit memeli promotörü. Yapısal olarak ifade edildi. Poliadenilasyon (PolyA) sinyalleri Kısaltma Uzunluk Tarif SV40 PoliA 82-122 bg Simian virüsü 40 poliadenilasyon sinyali bGH PoliA 224 bg Sığır büyüme hormonu poliadenilasyon sinyali rbGlob PoliA 56 bg Tavşan beta globin poliadenilasyon sinyali Tablo 1: Promotörler ve poliadenilasyon sinyalleri. Adım Sıcaklık Saat Döngü Enzim aktivasyonu 95°C 10 dakika 1 adet Denatürasyon 94°C 30 saniye 42x Tavlama 60°C 1 dakika Uzantı 72°C 30 saniye Enzim deaktivasyonu 98°C 10 dakika 1 adet Tutmak 4°C ∞ Tablo 2: Dijital damlacık PCR programı. 3. HSPC’lerin düzenlenmesi HSPC’lerin transfeksiyonu ve transdüksiyonuCD34 + HSPC’leri çözün ve hücreleri, 10 dakika boyunca RT’de 350 x g’de% 1 P / S. Santrifüj ile desteklenmiş 10 mL önceden ısıtılmış RPMI’ye aktarın. HSPC tutma ortamındaki hücreleri 2.5 x 105 hücre / mL konsantrasyonuna askıya alın ve 48 saat -72 saat boyunca 37 °C / % 5 CO 2’de inkübe edin. Hücreleri 15 mL’lik bir tüpte toplayın. Hücreleri sayın ve tripan mavisi dışlama ile hücre canlılığını kontrol edin. 2 x 10 5 ile5 x 10 arasında6 hücre tek bir küvette çekirdeklendirilebilir. Hesaplanan hücre numaranıza bağlı olarak uygun sayıda küvet hazırlayın. RNP kompleksini hazırlayın. 1,5 mL’lik bir tüpte, 15 μg Cas9 ve 8 μg sgRNA (molar oran 1: 2.5) ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca 25 ° C’de inkübe edin. RNP kompleksi inkübe edilirken, hücreleri 5 dakika boyunca 350 x g’de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücreleri 100 μL nükleofeksiyon çözeltisi içinde askıya alın. Hücreleri RNP kompleksi ile karıştırın ve küvete aktarın. Transfer sırasında oluşmuş olabilecek artık hava kabarcıklarını çıkarmak için küvete hafifçe dokunun. Küvetleri transfeksiyon sisteminin tutucusuna yerleştirin ve hücreleri daha önce sgRNA tasarım bölümünde açıklandığı gibi elektroporat yapın. Elektroporasyondan hemen sonra, P/S olmadan 400 μL önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı ekleyin ve ince transfer pipeti olan hücreleri, P/S olmadan 500 μL önceden ısıtılmış HSPC tutma ortamı içeren bir doku kültürü plakasına aktarın. hücre numarasına bağlı olarak, 0,25 x 10 6 ile 1 x 10 6 hücre/mL arasında bir yoğunluğa ulaşmak için uygun bir kültür plakası (24-, 12- veya6-well plate) kullanın. Plakayı inkübatöre 37 °C / % 5 CO2’de aktarın. Dondurulmuş rAAV’leri içeren şişeleri buz üzerinde çözün. Her rAAV6’nın optimal miktarını hücre süspansiyonuna pipetleyerek hücreleri dönüştürün. Yüksek iletim verimliliği elde etmek için elektroporasyondan sonraki 20-30 dakika içinde transdüksiyonu gerçekleştirin.NOT: Her virüsün optimum konsantrasyonu (WT HDR şablonu için bir virüs ve mutasyona uğramış HDR şablonu için başka bir ayrı virüs) deneysel olarak belirlenmelidir. Genellikle, 5.000-10.000 GC / hücre (örneğin, 1 x 106 hücre için 5 x 109 GC) yüksek transdüksiyonla sonuçlanır. Hücre süspansiyonunu pipetle nazikçe karıştırın. Dönüştürülmüş hücreleri 37 °C / % 5 CO 2’de 6-8 saat boyuncainkübe edin. 6-8 saat sonra, hücreleri bir tüp içinde toplayın ve 5 dakika boyunca RT’de 350 x g’de santrifüj yapın. Eski ortamı atın ve P / S ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış taze HSPC tutma ortamı ile değiştirin. Hücreleri 2.5 x 10 5-5 x 105 hücre / mL arasındaki bir konsantrasyonda askıya alın ve dokuyla işlenmişbir hücre kültürü plakasına (24-, 12- veya 6-well plate) aktarın. Sıralamaya geçmeden önce hücreleri 48 saat boyunca 37 °C / % 5 CO2’de inkübe edin. Heterozigot GOF mutasyonunu taşıyan mühendislik HSPC’lerinin akış sıralamasıHücreleri 15 mL’lik bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca RT’de 350 x g’de santrifüj yapın. Süpernatanı çıkarın, hücreleri% 0.1 BSA içeren 1 mL DPBS’de askıya alın ve 5 dakika boyunca RT’de 350 x g’de tekrar santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre numarasına bağlı olarak hücreleri uygun bir DPBS + % 0.1 BSA hacminde askıya alın.NOT: Sıralayıcının tıkanma riskini azaltmak için hücrelerin minimum 200 μL hacimde askıya alınması ve 1 x 107 hücre/mL’yi geçmemesi önerilir. Hücreleri bir kapakla donatılmış steril bir FACS tüpüne aktarın. Canlı / ölü hücre dışlaması için hücre süspansiyonuna 7-AAD veya başka bir canlılık boyası (floresan proteinleriyle uyumluluklarına bağlı olarak) ekleyin. Floresan muhabir proteinleri için çift pozitif olan canlı hücreleri, 200 μL HSPC tutma ortamı içeren bir toplama tüpüne ayırın.NOT: Sıralama prosedürü sırasında uygun geçişi sağlamak için yalnızca AAV’lerle dönüştürülen hücrelerden oluşan uygun kontroller eklenmelidir. Sıralanmış hücreleri RT’de 350 x g’de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve kültürde daha fazla genişleme için HSPC tutma ortamındaki hücreleri 2.5 x 105 hücre / mL konsantrasyonunda askıya alın veya hücreleri doğrudan fonksiyonel testler için kullanın. 4. Başarılı gen düzenlemesinin doğrulanması Genomik DNA ekstraksiyonuBaşlamadan önce, ısıtma bloklarını 65 ° C ve 98 ° C’ye ayarlayın. 2 x 105 genom tarafından düzenlenmiş ve sıralanmış saflaştırılmış hücreleri hasat edin ve 5 dakika boyunca 350 x g’de santrifüj yapın. Daha önce açıklandığı gibi gDNA’yı ayıklayın. DNA çözeltisini doğrudan PCR için kullanın veya -20 ° C’de saklayın. Giriş-Çıkış PCR5′ yerleştirme bölgesini yükseltmek için iki primer tasarlayın (Şekil 4A): primer ileri 1, sol homoloji kolunun dışındaki genomik lokusu hedefler; astar ters 2, entegre diziyi hedefler. Giriş-çıkış PCR için, reaksiyon başına aşağıdaki PCR karışımını hazırlayın:10 μL PCR Master Mix (2x; bkz.1 μL ileri astar 1 (10 μM stok)1 μL astar ters 2 (10 μM stok)Ekstrakte edilmiş DNA’nın 0.5-1.0 μLNükleaz içermeyenH2O, 20 μL’lik son hacme kadarNOT: Birden fazla reaksiyon için, pipetleme hatalarını hesaba katmak üzere fazladan bir reaksiyon içeren bir ana karışım hazırlanması önerilir. Alay ile muamele edilmiş bir örnekten şablon olmayan bir kontrol ve şablon DNA eklemek önemlidir. PCR reaksiyonlarını uygun termal döngü programı ile çalıştırın (üreticinin talimatlarına bakın).NOT: Öncelikle optimum tavlama sıcaklığı için astar çiftinin test edilmesi önerilir. Bu, Tm’yi hesaplayarak ve daha sonra PCR’yi gradyan sıcaklığı gerçekleştirebilen bir termosikler ile çalıştırarak yapılabilir. PCR ürünlerini DNA merdiveni ile 100 V’ta 100 V’ta 45-60 dakika boyunca %1,5’lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın (Şekil 4B). Jeli mavi bir ışık veya UV transilluminator üzerine yerleştirin. Bantları jelden tüketin. Bir DNA jel ekstraksiyon kiti kullanarak DNA’yı bantlardan çıkarın. Endojen gen lokusunda istenen cDNA’nın doğru ve kesintisiz entegrasyonunu doğrulamak için ekstrakte edilen PCR örneklerini Sanger dizilimi için uygun primerlerle gönderin. Şekil 4: Genomik entegrasyonun in-out PCR ile doğrulanması. (A) In-out PCR stratejisinin şematik gösterimi. Tasvir edilen stratejide, iki astar tasarlandı. Primer ileri 1, LHA’nın dışındaki genomik lokusu hedefler ve primer ters 2, kodon için optimize edilmiş diziyi hedefler. (B) Bir agaroz jel elektroforezinin şematik gösterimi. Yalnızca başarılı bir şekilde düzenlenmiş hücreler (RNP + AAV), içeri-dışarı PCR sırasında bir PCR ürünü oluştururken, düzenlenmemiş örnekler (yalnızca AAV) bir PCR ürünü oluşturmaz. Kısaltma: NTC = şablon dışı denetim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.