Engineering oncogene heterozygote gain-of-function mutaties in menselijke hematopoietische stam- en voorlopercellen

Dit protocol vereist het gebruik van gezonde van donoren afgeleide CD34+ HSPC’s en vereist ethische goedkeuring van de lokale institutionele toetsingscommissies (IRB) en ondertekende geïnformeerde toestemming. De CD34+ HSPC’s die in dit protocol werden gebruikt, werden geïsoleerd uit het navelstrengbloed (UCB) van termijnleveringen (>34 weken zwangerschap). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de moeders voorafgaand aan de bevalling, en ethische goedkeuring voor de inzameling van UCB werd verkregen (IRB-goedkeuring: 31-322 ex 18/19) van de Medische Universiteit van Graz. Een volledige lijst van materialen die in dit protocol worden gebruikt, is te vinden in de tabel met materialen. 1. sgRNA-ontwerp en evaluatie van snij-efficiëntie Zoek naar de locatie van de gewenste mutatie en het juiste transcript op een online databasetool (bijv. COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Selecteer een sgRNA naast de mutatie (exonische targeting) of in de vorige intron (intronic targeting) met behulp van een sgRNA-ontwerptool. In dit protocol wordt de online tool van Benchling gebruikt. Zie De tabel met materialen voor een lijst met mogelijke online tools voor sgRNA-ontwerp. Selecteer de optie + (maken) > DNA-sequentie > DNA-sequenties importeren > importeren uit databases. Voer het gewenste gen in, bijvoorbeeld CALR en selecteer de mens als de soort > Zoek > Selecteer het juiste transcript (bijv. CALR-201 -ENST00000316448) > Import. Selecteer de regio waarin u de DS-pauze wilt introduceren (bijvoorbeeld intron 7). Selecteer de CRISPR-optie aan de rechterkant van het scherm en selecteer Hulplijnen ontwerpen en analyseren. Selecteer enkele hulplijn, houd de lengte van de gids op 20 bp en PAM-reeks voor bewerking met SpCas9 (NGG). Kies een gids met een hoge on-target score (hoge kans op bewerking op de gewenste locus) en een hoge off-target score (lage kans op bewerken bij ongewenste loci). Kies ten minste drie gidsen om te testen om het best presterende sgRNA te vinden. Bestel het sgRNA als chemisch gemodificeerd synthetisch sgRNA bij een commerciële leverancier.OPMERKING: Het is in dit stadium raadzaam om een kleine hoeveelheid van de synthetische sgRNA’s voor het eerste scherm te bestellen. Zodra een goed presterend sgRNA is geïdentificeerd, gaat u verder met een grotere orde van het geselecteerde sgRNA. Ontdooi 2 x 105-5 x 105 CD34+ HSPC’s. Breng de cellen over in 10 ml voorverwarmd RPMI1640 aangevuld met 1% antibiotica (bijv. Penicilline / streptomycine).OPMERKING: CD34+ HSPC’s met een zuiverheid >90% moeten worden gebruikt om de beste en meest reproduceerbare resultaten te bereiken. Centrifugeer bij 350 x g bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 min. Tel de cellen met een hemocytometer en suspensie de cellen in SFEM II-medium aangevuld met 0,2% penicilline /streptomycine (P / S), 100 ng / ml trombopoietine (TPO), 100 ng / ml stamcelfactor (SCF), 100 ng / ml FMS-achtig tyrosinekinase 3 ligand (FLT3L), 100 ng / ml interleukine-6 (IL-6), 35 nM UM171 en 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) tot een concentratie van 2,5 x 105 cellen / ml . Incubeer bij 37 °C/5% CO2 gedurende 48 h – 72 h.OPMERKING: Het volledige medium wordt voortaan het HSPC-retentiemedium genoemd. Verzamel de cellen in een buis van 15 ml en tel de cellen. Controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-uitsluiting.Voordat u begint, schakelt u het transfectiesysteem in en selecteert u de optie voor de cuvetten. Selecteer het juiste programma en de juiste nucleofectieoplossing voor HSPC’s (zie Materiaaltabel). Tussen 2 x 105 en 5 x 10kunnen 6 cellen worden gekernamineerd in één cuvette van 100 μL. Zet een klein aantal cellen opzij (bijv. 1 x 105-2 x 105) om gedurende 48 uur in cultuur te houden om als WT-controle te worden gebruikt. Bereid het RNP-complex voor. Voeg in een buis van 1,5 ml 15 μg Cas9 en 8 μg sgRNA (molaire verhouding 1:2,5) toe en incubeer bij 25 °C gedurende 10 minuten in een verwarmingsblok. Terwijl het RNP-complex broedt, centrifugeer je de cellen op 350 x g bij RT gedurende 5 minuten en gooi je het supernatant weg met behulp van een pipet. Suspensie de cellen in 100 μL nucleofectionoplossing. Meng de cellen met het RNP-complex en breng over in de cuvette. Tik voorzichtig op de cuvette om eventuele luchtbellen te verwijderen die zich tijdens de overdracht hebben gevormd. Steek de cuvette in de houder van het transfectiesysteem en elektroporaat de cellen met het DZ-100-programma. Voeg onmiddellijk na elektroporatie 400 μL voorverwarmd HSPC-retentiemedium toe zonder P/S. Breng de cellen met een fijne transferpipet over in een kweekplaat met voorverwarmd HSPC-retentiemedium zonder P/S. Gebruik, afhankelijk van het celnummer, een geschikte kweekplaat (24-, 12- of 6-wellsplaat) om een dichtheid tussen 0,25 x 106 en 1 x 106 cellen/ml te bereiken. Breng de plaat over naar de incubator bij 37 °C/5% CO2. Incubeer de nucleofecteerde cellen gedurende 6-8 uur. Verwijder na 6-8 uur het oude medium en vervang het door vers voorverwarmd HSPC-retentiemedium aangevuld met P / S. Suspensie de cellen in een concentratie tussen 2,5 x 105 en 5 x 105 en breng over naar een celkweekplaat (24-, 12- of 6-wellsplaat). Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37°C/5% CO2. Oogst 2 x 105 cellen en centrifugeer bij 350 x g bij RT gedurende 5 min. Stel voordat u begint de verwarmingsblokken in op 65 °C en 98 °C. Gooi het supernatant weg en hang de cellen in 1 ml 1x DPBS in een buis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 350 x g bij RT gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en suspensie de cellen in 50 μL DNA-extractieoplossing. Vortex voor 15 s. Incubeer gedurende 6 min bij 65 °C. Vortex gedurende 15 s en incubeer gedurende 2 min bij 98 °C. Versterk het gebied van de DSB door PCR met behulp van primers die een amplicon van ongeveer 400-600 bp genereren met de DSB in het midden. Gebruik 0,5-1 μL geëxtraheerd DNA voor de PCR-reactie.OPMERKING: Vanwege de samenstelling van de DNA-extractieoplossing kunnen de DNA-concentraties niet nauwkeurig worden gekwantificeerd door spectrofotometrie. Voer het PCR-product met een DNA-ladder uit op een 1,5 % agarose-gel bij 100 V gedurende 45-60 minuten. Plaats de gel op een blauw licht of UV-transilluminator. Haal de DNA-band van de juiste grootte uit de gel met behulp van een in de handel verkrijgbare kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Rangschik de monsters door Sanger-sequencing met behulp van de voorwaartse primer of omgekeerde primer van de PCR. Voor PCR-producten met een lengte van 400-600 bp is 75 ng DNA nodig voor sequencing met een concentratie van 5 ng/ml in een totaal volume van 15 μL. Analyseer de bewerkingsefficiëntie van de sgRNA’s door de sequencingbestanden te uploaden naar een programma dat is ontworpen om de bewerkingsefficiëntie te berekenen door de invoeging en verwijderingen te identificeren die door het sgRNA worden geproduceerd. Selecteer het best presterende sgRNA om mee door te gaan.OPMERKING: Speciale online tools worden vermeld in de materiaaltabel. Deze analyse vereist de .ab1-bestanden van de getransfecteerde en WT HSPC’s, de sgRNA-sequentie en de PAM-sequentie. 2. Homologie-gerichte reparatie (HDR) vectorconstructie HDR-sjabloonontwerpOPMERKING: Er moeten twee HDR-sjablonen worden ontworpen: een sjabloon voor de WT-reeks en een sjabloon voor de gemuteerde reeks.Importeer de genomische sequentie en de coderingssequentie (CDS) van het gewenste gen in een geschikte software voor moleculair klonen (speciale hulpmiddelen zijn te vinden in de tabel met materialen). Ontwerp uit het genomische sequentiebestand de linker homologiearm (HA) door idealiter 400 bp te selecteren aan het 5′-uiteinde van de DSB. Plak deze reeks in een nieuw bestand. Als een intron wordt aangevallen met het sgRNA, moet een splice acceptor (SA) sequentie worden opgenomen. Selecteer de laatste 150 bp van de beoogde intron en plak deze na de linker HA. Als het exon direct gericht is, is deze volgorde niet nodig (figuur 3). Selecteer in het CDS-bestand de interessante cDNA. In het geval dat een exonische sequentie wordt gericht, zorg er dan voor dat het cDNA onmiddellijk stroomafwaarts van de DSB-site begint en alle volgende exonen van het gen van belang en het stopcodon omvat. In het geval dat een intron wordt gericht, zorg er dan voor dat het cDNA begint met het eerste codon van het volgende exon. Codon-optimaliseer de cDNA en plaats deze na de SA-sequentie. Gebruik hiervoor speciale online tools (materiaaltabel). Plaats een polyadenylation (PolyA)-signaal van 3′ na het cDNA van belang (bijv. SV40 of bGH) (tabel 1). Voeg na de PolyA een promotorsequentie in (bijv. miltfocusvormend virus [SFFV] of polyubiquitine C [UBC], tabel 1) voor het fluorescerende eiwit. Plaats de sequentie voor het fluorescerende eiwit (d.w.z. GFP, BFP of mCherry). Plaats een tweede maar ander PolyA-signaal.OPMERKING: Het invoegen van een andere PolyA-sequentie voorkomt problemen zoals bacteriële recombinatie van het plasmide of problemen met het uitlijnen van de sequentie vanwege twee identieke sequenties in de sjabloon. Ontwerp uit het genomische sequentiebestand de juiste HA door idealiter 400 bp te selecteren aan het 3′-uiteinde van de DSB. Plaats deze reeks na de tweede PolyA. Maak een kopie van de hele sjabloon en wijzig het cDNA van belang zodat het de volgorde van de gewenste mutatie bevat. Wissel het fluorescerende eiwit uit met een ander fluorescerend eiwit. Als GFP bijvoorbeeld is gebruikt voor de WT-sjabloon, wisselt u deze in met BFP of mCherry voor de mutantensjabloon. Construeer en kloon de HDR-sjablonen in het pAAV-MCS-plasmide (of andere geschikte backbones).OPMERKING: De fragmenten die nodig zijn voor de assemblage kunnen worden geproduceerd door PCR of commercieel worden besteld en moeten overlappende sequenties bevatten met hun aangrenzende fragmenten. Als de mutatie van belang een puntmutatie, een kleine insertie of een kleine deletie is, kan het gemuteerde cDNA door PCR worden geproduceerd door een locatiegerichte mutagenese uit te voeren op de HDR-sjabloon die de WT cDNA bevat. Transformeer competente Escherichia coli met het geassembleerde product met behulp van de heat shock-methode. Plaats voordat je begint de bacteriën om te ontdooien op ijs gedurende 10 minuten. Voeg 2 μL van de geassembleerde producten toe aan 50 μL bacteriën. Meng de inhoud door zachtjes te vegen. Leg de monsters gedurende 30 minuten op ijs. Breng de monsters gedurende 30 s over naar een thermoblok op 42 °C. Breng de monsters gedurende 5 minuten over op ijs. Voeg 450 μL SOC-medium op kamertemperatuur toe en incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 1 uur. Verdeel de monsters over LB-agarplaten die ampicilline bevatten. Verdeel voor elk monster 100 μL van drie verschillende verdunningen van de bacteriële oplossing (onverdund, 1:5 en 1:10) om LB-agarplaten te verkrijgen met enkele kolonies die kunnen worden geplukt. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C. Kies de volgende dag drie kolonies per monster. Breng de kolonies over in buizen van 15 ml met doppen met 4 ml LB-medium aangevuld met ampicilline en incubeer ‘s nachts in een shaker bij 37 °C. Aliquot 500 μL van de bacteriële oplossing uit elke kolonie en bewaar het in de koelkast voor later gebruik. Voer een mini-voorbereiding uit om plasmide-DNA te extraheren volgens de instructies van de fabrikant. Stuur de monsters voor Sanger-sequencing om de juiste assemblage van de plasmiden te bevestigen. Gebruik voldoende primers verdeeld over het plasmide om een ononderbroken sequentiebevestiging te garanderen, idealiter om elk gebied twee keer te bedekken met voorwaartse en omgekeerde metingen. Voeg 200 μL van de bacteriële oplossing die het correct geassembleerde plasmide bevat toe aan 200 ml LB-media aangevuld met ampicilline en incubeer in een shaker gedurende een nacht bij 37 °C. Voer een midi- of maxi-prep uit om het plasmide-DNA te extraheren volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het plasmide-DNA bij −20 °C. Recombinante AAV6-voorbereidingOPMERKING: Er moeten twee afzonderlijke AAV6-voorbereidingen worden uitgevoerd: één voor de rAAV6 met de WT HDR-sjabloon en één voor de rAAV6 met de gemuteerde HDR-sjabloon. In dit gedeelte worden de stappen beschreven die nodig zijn voor de bereiding van slechts één virus.Ontdooi HEK293T-cellen, breng de cellen over in 10 ml voorverwarmde DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% P / S en 25 mM HEPES en centrifugeer bij 350 x g bij RT gedurende 5 minuten. Suspensie de cellen in een concentratie van 1 x 105 cellen/ml en breng ze over in een geschikte kolf (bijvoorbeeld een kolf van 175 cm2 ). Breng de kolf over in een broedmachine bij 37 °C/5% CO2.OPMERKING: HEK293T-cellen moeten van tevoren worden ontdooid om de cellen volledig te laten herstellen en een voldoende aantal cellen te verkrijgen (11 x 107 cellen zijn nodig voor de productie van één virus). Het wordt aanbevolen om de cellen na minimaal drie passages te gebruiken en de cellen onder de 20 passages te houden. HEK293T-cellen moeten drie keer per week worden gesplitst. Met behoud van de cellen mogen deze niet groter zijn dan 70% -80% samenvloeiing. De DMEM die in het AAV-preparaat wordt gebruikt, moet ook al worden aangevuld met L-glutamine en natriumpyruvaat. Verzamel de cellen in een buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij RT. Suspensie de cellen in 20 ml DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% P / S en 25 mM HEPES en tel met een hemocytometer. Gebruik trypan blue voor het uitsluiten van dode cellen. Zaad 3 x 106 cellen in 20 ml DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% P/S en 25 mM HEPES in een 175 cm2 kolf. Bereid voor de productie van één virus ten minste vier kolven van 175 cm2 . Incubeer de cellen bij 37 °C/5% CO2 gedurende 3 dagen.OPMERKING: Deze stap kan het beste op een vrijdag worden uitgevoerd, omdat het de cellen in staat stelt om tijdens het weekend uit te breiden. Oogst en tel de HEK293T cellen. Bereid voor de bereiding van een van de virussen tien schotels van 150 mm met elk 11 x 106 HEK293T in 20 ml DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% P / S en 25 mM HEPES. Zet de gerechten in de couveuse op 37 °C/5% CO2 gedurende 24 uur. Gooi het oude medium voorzichtig weg en vervang door 20 ml antibioticavrije DMEM aangevuld met 10% FBS, 25 mM HEPES en 1 mM natriumbutyraat. Controleer voordat u verder gaat of de samenvloeiing van de cellen niet hoger is dan 80%. Bereid twee buizen van 15 ml die de transfectiemengsels bevatten. Voeg aan buis 1 5 ml gereduceerd serummedium, 60 μg rAAV6 gemuteerd HDR-plasmide en 220 μg pDGM6 (helperplasmide) toe. Voeg aan buis 2 5 ml gereduceerd serummedium en 1120 μl polyethylenimine-oplossing (PEI, transfectiereagens) toe aan buis 2. Voeg de inhoud van buis 2 toe aan buis 1 en vortex gedurende 30 s. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT om een goede inkapseling van het DNA in de PEI-micellen te garanderen.OPMERKING: Bewaar de oplossing niet langer dan 20 minuten. Voeg voorzichtig druppelsgewijs 1,1 ml van de oplossing toe aan elk gerecht en verdeel door voorzichtig te draaien. Zet de gerechten in de incubator op 37 °C/5% CO2 gedurende 48 uur. Voeg na 48 uur 250 μL 0,5 M EDTA toe aan elk gerecht en plaats de gerechten gedurende 10 minuten in de couveuse. Oogst de cellen door ze van de schaal te wassen en over te brengen naar een centrifugebuis van 500 ml of meerdere buizen van 50 ml. Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Om de volledige verwijdering van het supernatant te garanderen, moet u opnieuw centrifugeren bij 2.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C. Gooi alle resterende supernatant weg. Elk resterend supernatant kan de viruszuivering aantasten. Maak de pellet los door vortexing en extraheer het virus met behulp van een AAV-zuiveringskit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. U kunt ook extractie uitvoeren door iodixanol gradiënt ultracentrifugatie30,31. Aliquot het gezuiverde virus en bewaar bij −80 °C. Titreer de AAV functioneel of kwantificeer de AAV-titer door middel van digitale druppel PCR (ddPCR)32 om de optimale transductiecondities te bepalen. Herhaal dit proces voor de bereiding van het rAAV6 WT HDR plasmide. AAV-titratie door ddPCRStel voordat u begint de verwarmingsblokken in op 65 °C en 98 °C. Extraheer viraal DNA door 15 μL DNA-extractieoplossing toe te voegen aan 5 μL van het virus. Vortex voor 15 s. Incubeer gedurende 6 min bij 65 °C. Vortex voor 15 s. Incubeer gedurende 2 minuten bij 98 °C. Gebruik het geëxtraheerde DNA (een 1:4 verdunning van het virale DNA) om seriële verdunningen (1:400, 1:40.000, 1:160.000, 1:640.000) te bereiden met nucleasevrij (nf) H2O voor de ddPCR.OPMERKING: De verdunningen kunnen worden bewaard bij −20 °C als de ddPCR niet onmiddellijk wordt uitgevoerd. Selecteer drie van de verdunningen voor de ddPCR. De keuze van de te gebruiken verdunning hangt af van de concentratie van het virus. Gebruik bij voorkeur drie verschillende verdunningen (bijv. 1:40.000, 1:160.000 en 1:640.000) om de beste verdunning te vinden die binnen de detectiegrens van de machine valt. Houd de reagentia op ijs tijdens het werk. Bereid een hoofdmix voor (alle monsters worden in duplicaten gemeten). Bereid voor elke reactie het volgende: 12,5 μL ddPCR Supermix voor probes, geen dUTP, 1,25 μL PrimeTime Std qPCR Assay, AAV-ITR (zie Materiaaltabel) en 6,25 μL nf-H2O. Meng 5 μL DNA met 20 μL van de mastermix. Voer dit uit voor de verdunningen 1:40.000, 1:160.000 en 1:640.000. Plaats een cartridge in de cartridgehouder. Voeg 70 μL druppelolie toe aan de sondes in de rij die als olie wordt aangeduid. Pas op dat je geen bubbels genereert. Voeg 20 μL van het monstervolume toe in de rij die als monster wordt aangeduid. Pas op dat je geen bubbels genereert. Sluit de patroon af met de pakking en plaats deze in de druppelgenerator. Genereer de druppels door op de startknop op de machine te drukken, verwijder de pakking en breng voorzichtig, met een meerkanaals pipet, 40 μL van de gegenereerde druppels over in een 96-well plaat. Werk langzaam om vernietiging van de druppels en luchtbellen te voorkomen. Sluit de 96-well plaat af met pierce foil (de rode streep naar boven gericht) met behulp van de PCR platensealer. Plaats de plaat in een thermocycler. Stel het volume in op 40 μL, de dekseltemperatuur op 105 °C en de hellingsnelheden op 2 °C/s. Voer het PCR-programma uit zoals beschreven in tabel 2. Zet de druppellezer 30 minuten voor gebruik aan. Open de software op het bureaublad. Voer de plaatindeling in en selecteer ABS op het experimenttabblad en ddPCR Supermix op het tabblad Supermix. Druk vervolgens eerst op PRIME, gevolgd door op FLUSH SYSTEM op de software te klikken om het systeem te starten. Voer de plaat in de lezer in. Start de run en exporteer de gegevens als u klaar bent als csv-bestand voor verdere analyse als spreadsheet.OPMERKING: De getallen die door de software worden gegenereerd, zijn genoomkopieën (GC) per μL. Deze moeten worden vermenigvuldigd met de verdunningsfactoren: GC/μL x 5 (verdunning van het DNA in het mastermengsel) x initiële verdunning (d.w.z. 40.000 of 160.000). Figuur 3: Schematisch overzicht van intronische en exonische targeting tijdens CRISPR/Cas9 HDR knock-in. Schematische vergelijking tussen intronische en exonische targetingstrategieën voor CRISPR / Cas9 HDR knock-in. (A) Tijdens intronisch richten wordt een dubbelstrengsbreuk ingebracht in een intron van het DNA. De HDR-sjabloon bestaat uit een LHA-, cDNA-reeks en RHA. De intronische targeting vereist bovendien de aanwezigheid van een slice acceptor met de 3 ‘splice site, branch point en het polypyrimidinekanaal. Dit zorgt voor een correcte splicing. Het groene vak met stippen vertegenwoordigt het gebied dat overeenkomt met de SA-reeks. De grootte van de SA is 150 bp. (B) Exonische targeting is afhankelijk van de productie van een dubbelstrengs breuk direct in het exon. De HDR-sjabloon bestaat uit een LHA-, cDNA-reeks en RHA. De oranje gestippelde vakken geven de gebieden aan die overeenkomen met de LHA en RHA. De ideale grootte van de HAs is 400 bp elk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Initiatiefnemers Naam Lengte Beschrijving SFFV 492 bp Milt Focus Vormen Virus promotor. Sterke zoogdierpromotor. Constitutief uitgedrukt UBC 400 bp Promotor afgeleid van het humane ubiquitine C-gen. Constitutief uitgedrukt. Cmv 508 bp Promotor afgeleid van het Cytomegalovirus. Het kan een enhancer-regio bevatten. Constitutief uitgedrukt. Sterke zoogdierpromotor. Kan het zwijgen worden opgelegd. EF-1a 1182 bp Menselijke eukaryote translatie-elongatiefactor 1 alfapromotor. Constitutief uitgedrukt. Sterke zoogdierpromotor. EFS 200-300 bp EF-1 alfa-intron-loze korte vorm CAG 584 bp Hybride zoogdierpromotor met de CMV early enhancer (C), de chicken beta actin promoter (A) en de splice acceptor voor het rabbit beta-globin gen (G). Constitutief uitgedrukt. Polyadenylation (PolyA) signalen Afkorting Lengte Beschrijving SV40 PolyA 82-122 bp Simian virus 40 polyadenylation signaal BGH PolyA 224 bp Bovine groeihormoon polyadenylation signaal RbGlob PolyA 56 bp Konijn beta globine polyadenylation signaal Tabel 1: Promotors en polyadenylation signalen. Stap Temperatuur Tijd Cycli Enzymactivering 95°C 10 minuten 1x Denaturatie 94 °C 30 seconden 42x Annealing 60°C 1 minuut Extensie 72 °C 30 seconden Enzym deactivering 98 °C 10 minuten 1x Houden 4 °C ∞ Tabel 2: Digitaal druppel PCR-programma. 3. Bewerken van HSPC’s Transfectie en transductie van HSPC’sOntdooi CD34+ HSPC’s en breng de cellen over in 10 ml voorverwarmd RPMI aangevuld met 1% P/S. Centrifugeer bij 350 x g bij RT gedurende 10 minuten. Suspensie de cellen in HSPC-retentiemedium tot een concentratie van 2,5 x 105 cellen /ml en incubeer bij 37 °C/5% CO2 gedurende 48 h – 72 h. Oogst de cellen in een buis van 15 ml. Tel de cellen en controleer de levensvatbaarheid van de cel door trypan blue-uitsluiting. Tussen 2 x 105 en 5 x 10kunnen 6 cellen worden gekernamineerd in een enkele cuvette. Bereid het juiste aantal cuvetten voor, afhankelijk van uw berekende celnummer. Bereid het RNP-complex voor. Voeg in een buis van 1,5 ml 15 μg Cas9 en 8 μg sgRNA (molaire verhouding 1:2,5) toe en incubeer bij 25 °C gedurende 10 minuten in een verwarmingsblok. Terwijl het RNP-complex broedt, centrifugeer je de cellen gedurende 5 minuten op 350 x g en gooi je het supernatant weg. Suspensie de cellen in 100 μL nucleofectionoplossing. Meng de cellen met het RNP-complex en breng over in de cuvette. Tik voorzichtig op de cuvette om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen die zich tijdens de overdracht hebben gevormd. Plaats het cuvet in de houder van het transfectiesysteem en elektroporaat de cellen zoals eerder beschreven in de sgRNA-ontwerpsectie. Voeg onmiddellijk na elektroporatie 400 μL voorverwarmd HSPC-retentiemedium zonder P/S toe en breng de cellen met een fijne transferpipet over in een weefselkweekplaat met 500 μL voorverwarmd HSPC-retentiemedium zonder P/S. Gebruik, afhankelijk van het celnummer, een geschikte kweekplaat (24-, 12- of 6-wellsplaat) om een dichtheid te bereiken tussen 0,25 x 106 en 1 x 106 cellen/ml. Breng de plaat over naar de incubator bij 37 °C/5% CO2. Ontdooi de injectieflacons met de bevroren rAAVs op ijs. Transduceer de cellen door de optimale hoeveelheid van elke rAAV6 naar de celsuspensie te pipetteren. Voer de transductie uit binnen 20-30 minuten na de elektroporatie om hoge transductie-efficiënties te krijgen.OPMERKING: De optimale concentratie van elk virus (één virus voor de WT HDR-sjabloon en een ander afzonderlijk virus voor de gemuteerde HDR-sjabloon) moet experimenteel worden bepaald. Gewoonlijk resulteren 5.000-10.000 GC / cel (bijv. 5 x 109 GC voor 1 x 106 cellen) in hoge transductie. Meng de celsuspensie voorzichtig met de pipet. Incubeer de getransduceerde cellen gedurende 6-8 uur bij 37 °C/5% CO2. Na 6-8 uur verzamelt u de cellen in een buis en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 350 x g bij RT. Gooi het oude medium weg en vervang het door vers voorverwarmd HSPC-retentiemedium aangevuld met P/S. Suspensie de cellen in een concentratie tussen 2,5 x 105-5 x 105 cellen / ml en breng over naar een met weefsel behandelde celkweekplaat (24-, 12- of 6-wellsplaat). Incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 °C/5% CO2 voordat u verder gaat met sorteren. Flowsortering van de gemanipuleerde HSPC’s met de heterozygote GOF-mutatieOogst de cellen in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g bij RT. Verwijder het supernatant, suspensie de cellen in 1 ml DPBS met 0,1% BSA en centrifugeer opnieuw bij 350 x g bij RT gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg en hang de cellen op in een geschikt volume DPBS + 0,1% BSA, afhankelijk van het celnummer.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de cellen op te schorten bij een minimumvolume van 200 μL en niet meer dan 1 x 107 cellen / ml om het risico op verstopping van de sorteerder te verminderen. Breng de cellen over in een steriele FACS-buis uitgerust met een dop. Voeg 7-AAD of andere levensvatbaarheidskleurstof (afhankelijk van hun compatibiliteit met de fluorescerende eiwitten) toe aan de celsuspensie voor uitsluiting van levende / dode cellen. Sorteer de levende cellen die dubbel positief zijn voor de fluorescerende reportereiwitten in een verzamelbuis met 200 μL HSPC-retentiemedium.OPMERKING: Er moeten passende controles worden toegevoegd die bestaan uit cellen die alleen met AAV’s worden overgeladen om ervoor te zorgen dat de gaten tijdens de sorteerprocedure goed worden vastgezet. Centrifugeer de gesorteerde cellen bij 350 x g bij RT gedurende 5 minuten en suspensie de cellen in HSPC-retentiemedium in een concentratie van 2,5 x 105 cellen / ml voor verdere uitbreiding in cultuur of gebruik de cellen direct voor functionele testen. 4. Bevestiging van succesvolle genbewerking Genomische DNA-extractieStel voordat u begint de verwarmingsblokken in op 65 °C en 98 °C. Oogst 2 x 105 genoom-bewerkte en sorteer-gezuiverde cellen en centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 min. Extraheer de gDNA zoals eerder beschreven. Gebruik de DNA-oplossing direct voor PCR of bewaar bij −20 °C. In-Out PCROntwerp twee primers om de inbrengplaats van 5’ te versterken (figuur 4A): primer forward 1 richt zich op de genomische locus buiten de linker homologiearm; primer reverse 2 richt zich op de geïntegreerde reeks. Bereid voor de in-out PCR de volgende PCR-mix per reactie:10 μL PCR Master Mix (2x; zie Materiaaltabel)1 μL primer forward 1 (10 μM voorraad)1 μL primer reverse 2 (10 μM bouillon)0,5-1,0 μL geëxtraheerd DNANucleasevrij H2O tot een eindvolume van 20 μLOPMERKING: Voor meer dan één reactie is het raadzaam om een hoofdmix te bereiden die één extra reactie bevat om rekening te houden met pipetteerfouten. Het is belangrijk om een niet-sjablooncontrole en sjabloon-DNA op te nemen van een met mock behandeld monster. Voer de PCR-reacties uit met het juiste thermische cyclusprogramma (zie de instructies van de fabrikant).LET OP: Het is raadzaam om eerst het primerpaar uit te testen op de optimale gloeitemperatuur. Dit kan worden gedaan door de Tm te berekenen en vervolgens door de PCR uit te voeren met een thermocycler die een gradiënttemperatuur kan uitvoeren. Voer de PCR-producten met een DNA-ladder uit op een 1,5% agarose-gel bij 100 V gedurende 45-60 minuten (figuur 4B). Plaats de gel op een blauw licht of UV-transilluminator. Snijd de banden uit de gel. Haal het DNA uit de banden met behulp van een DNA-gelextractiekit. Stuur de geëxtraheerde PCR-monsters met de juiste primers voor Sanger-sequencing om de juiste en naadloze integratie van het gewenste cDNA op de endogene genlocus te bevestigen. Figuur 4: Validatie van genomische integratie door in-out PCR. (A) Schematische weergave van de in-out PCR-strategie. In de afgebeelde strategie werden twee primers ontworpen. De primer forward 1 richt zich op de genomische locus buiten de LHA en de primer reverse 2 richt zich op de codon-geoptimaliseerde sequentie. (B) Schematische weergave van een agarose gel elektroforese. Alleen bewerkte cellen (RNP + AAV) genereren een PCR-product tijdens de in-out PCR, terwijl de onbewerkte voorbeelden (alleen AAV) geen PCR-product genereren. Afkorting: NTC = non-template control. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.