الكشف البسيط والسريع القائم على تضخيم الدائرة لنشاط توبويزوميراز 1 في العينات البيولوجية الخام
Summary
تم وصف بروتوكول للكشف الحساس والكمي عن نشاط توبويزوميراز 1 باستخدام مقايسة الكشف عن نشاط الإنزيم المعزز بالدائرة المتدحرجة. تسمح الطريقة بالكشف عن نشاط توبويزوميراز 1 من المكونات المنقاة أو مستخلصات الخلايا / الأنسجة. يحتوي هذا البروتوكول على تطبيقات واسعة النطاق في أي مجال يتضمن الكشف عن النشاط الأنزيمي.
Abstract
تم استخدام التقنيات القائمة على التضخيم متساوي الحرارة مثل تضخيم الدائرة المتدحرجة بنجاح للكشف عن الأحماض النووية أو كميات البروتين أو الجزيئات الأخرى ذات الصلة. وقد أظهرت هذه الطرق أنها بدائل كبيرة لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو ELISA للتطبيقات السريرية والبحثية. علاوة على ذلك ، فإن الكشف عن كمية البروتين (عن طريق اللطخة الغربية أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية) غالبا ما يكون غير كاف لتوفير معلومات لتشخيص السرطان ، في حين أن قياس نشاط الإنزيم يمثل علامة حيوية قيمة. يسمح قياس نشاط الإنزيم أيضا بالتشخيص والعلاج المحتمل للأمراض التي تنقلها مسببات الأمراض. في جميع حقيقيات النوى ، تعد topoisomerases هي الإنزيمات الرئيسية المرتبطة بالحمض النووي المشاركة في التحكم في الحالة الطوبولوجية للحمض النووي أثناء العمليات الخلوية المهمة وهي من بين المؤشرات الحيوية المهمة لتشخيص السرطان وعلاجه.
على مر السنين ، تم التحقيق في topoisomerases بشكل كبير كهدف محتمل للأدوية المضادة للطفيليات والمضادة للسرطان مع مكتبات من المركبات الطبيعية والاصطناعية ذات الجزيئات الصغيرة التي يتم التحقيق فيها كل عام. هنا ، يتم تقديم طريقة تضخيم الدائرة المتدحرجة ، والتي تسمى فحص الكشف عن نشاط الإنزيم المعزز بالدائرة المتدحرجة (REEAD) والتي تسمح بالقياس الكمي لنشاط توبويزوميراز 1 (TOP1) بطريقة بسيطة وسريعة وخالية من الهلام. من خلال شق وربط ركيزة الحمض النووي المصممة خصيصا ، يقوم TOP1 بتحويل قليل النوكليوتيد DNA إلى دائرة مغلقة ، والتي تصبح نموذجا لتضخيم الدائرة المتدحرجة ، مما ينتج عنه ~ 103 منتجات دائرة درفلة ترادفية متكررة. اعتمادا على دمج النوكليوتيدات أثناء التضخيم ، هناك إمكانية لطرق قراءة مختلفة ، من التألق إلى التلألؤ الكيميائي إلى القياس اللوني. نظرا لأن كل ربط انقسام بوساطة TOP1 يولد دائرة DNA مغلقة واحدة ، فإن الفحص حساس للغاية وكمي بشكل مباشر.
Introduction
تنتمي Topoisomerases إلى فئة الإنزيمات المعدلة للحمض النووي وقد أثبت العديد منها فائدتها كمؤشرات حيوية للأمراض البشرية1،2،3،4،5،6. يشارك TOP1 في حل الإجهاد الطوبولوجي المرتبط بالعمليات الخلوية مثل تكرار الحمض النووي ، والنسخ الجيني ، وإعادة التركيب ، وفصل الكروموسومات7. يمكن ل TOP1 حل كل من الملفات الفائقة السلبية والإيجابية من خلال آلية تتضمن تكوين كسر عابر أحادي الشريط في الحمض النووي 8,9. بعد الارتباط بالحمض النووي ، يضع TOP1 التيروزين النشط (Tyr723) لأداء هجوم نووي على العمود الفقري للفوسفوديستر. ثم يتم إنشاء مركب انشقاق TOP1-DNA مع الإنزيم المرتبط تساهميا بالطرف 3 ‘من شريط الحمض النووي المكسور. هذا يطلق الإجهاد الالتوائي من خلال السماح للطرف 5 ‘من الشريط المشقوق بالدوران حول الخيط السليم. أخيرا ، تقوم مجموعة الهيدروكسيل من الطرف 5 بهجوم نووي على رابطة 3’-phosphotyrosyl. نتيجة لذلك ، يتم إطلاق TOP1 ، ويتم استعادة العمود الفقري للحمض النووي8.
تم تطوير العديد من المقايسات للتحقيق في خطوات الدورة التحفيزية TOP1 ، بما في ذلك مقايسة الاسترخاء10 ، ومقايسة إزاحة الحركة الكهربائية (EMSA) 11،12 ، ومقايسات ربط انقسام انتحار الحمض النووي 13،14 ، ومقايسة مجمع الإنزيمات في الجسم الحي (ICE) 15 . ومع ذلك ، فإن هذه المقايسات لها العديد من القيود لأنها تعتمد على الرحلان الكهربائي الهلامي ، والذي يتطلب عوامل إقحام الحمض النووي ، أو أنها تتطلب تدريبا ومعدات عالية التخصص. علاوة على ذلك ، تتطلب المقايسات كميات كبيرة من إنزيم TOP1 المنقى (تتراوح من 1 إلى 5 نانوغرام لمقايسة الاسترخاء و 50 إلى 200 نانوغرام ل EMSA ومقايسة ربط الانقسام) أو مقتطفات من 106 خلايا على الأقل لأداء الأداء الأمثل. لذلك ، تم تطوير طريقة حساسة للغاية تمكن من الكشف المحدد عن نشاط TOP1 في العينات البيولوجية الخام وعلى مستوى الحدث الحفاز الفردي ، تسمى مقايسة REEAD ،16.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول للكشف عن نشاط TOP1 باستخدام اختبار REEAD16 . يصور الشكل 1 تمثيلا تخطيطيا للمقايسة. يتم توصيل شبكة سيليكون مصممة خصيصا بشريحة وظيفية لإنشاء إعداد متعدد الآبار بشريحة زجاجية ، يسمى صانع الآبار في ما يلي (الشكل 1 أ). ويتبع ذلك اقتران برايمر معدل 5′-amino بمجموعات NHS الوظيفية في آبار الشريحة (الشكل 1B). يحول تفاعل الانقسام والربط بوساطة TOP1 ركيزة معينة من الحمض النووي إلى دائرة مغلقة. تطوى الركيزة الخاصة ب TOP1 (الشكل 1C) تلقائيا إلى شكل دمبل يحتوي على ساق مزدوج تقطعت به السبل وحلقتان مفردتان تقطعت بهما. إحدى الحلقات مكملة للبرايمر المثبت على السطح. تحتوي المنطقة الجذعية على موقع انقسام TOP1 المفضل بثلاث قواعد في اتجاه المنبع من الطرف 3 ‘و 5’-هيدروكسيل متدلي. يمكن تحقيق تعميم الركيزة باستخدام إما مستخلص الخلية / الأنسجة (الشكل 1C) أو TOP1 المؤتلف المنقى (الشكل 1D).
عندما يتم شق الركيزة بواسطة TOP1 ، يصبح الإنزيم مرتبطا بشكل عابر بالطرف 3 ‘وينتشر الجزء ثلاثي القواعد ، مما يسمح للبروز 5’-overpl بالالتك إلى الركيزة وتسهيل الربط بوساطة TOP1. ينتج عن الربط تعميم الركيزة وبالتالي تفكك TOP1. يتم تهجين الدائرة المغلقة إلى التمهيدي المثبت على السطح (الشكل 1E) وتستخدم كقالب لتضخيم دائرة الدرفلة متساوية الحرارة (RCA) بوساطة بوليميراز phi29 ، والذي يمكنه أداء RCA مع إزاحة الشريط ، مما ينتج عنه 103 منتجات تكرار ترادفي. خلال خطوة RCA ، يمكن دمج النيوكليوتيدات ذات العلامات الفلورية (الشكل 1F) أو النيوكليوتيدات المقترنة بالبيوتين (الشكل 1G)17. يسمح دمج النيوكليوتيدات الموسومة بالفلورسنت بالكشف عن RCPs إما باستخدام مجهر مضان أو ماسح ضوئي مضان. بدلا من ذلك ، يمكن للجسم المضاد المضاد للبيوتين المقترن ببيروكسيديز الفجل (HRP) (الشكل 1H) ربط النيوكليوتيدات البيوتينيلية ، مما يسمح باكتشاف منتجات الدائرة المدرفلة (RCPs) باستخدام إما التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) أو عن طريق تحويل 3،3 ‘، 5،5’-رباعي ميثيل بنزيدين (TMB) إلى لون يمكن اكتشافه. يتبع RCA حركية تفاعل خطي ، مما يجعل مقايسة REEAD كمية مباشرة ، حيث يمثل RCP واحدا تفاعل ربط انشقاق واحد بوساطة TOP1. هنا يظهر أنه يمكن استخدام هذا الفحص للكشف عن نشاط TOP1 كإنزيم مؤتلف منقى أو مستخرج من عينات خام وكأداة فحص للأدوية المضادة ل TOP1.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمثل Topoisomerases فئة من الإنزيمات المعدلة للحمض النووي التي تجذب اهتماما بحثيا وسريريا عاليا ، كونها هدفا لمركبات الجزيئات الصغيرة ذات التأثير المحتمل في العلاج المضاد للسرطان أو في مكافحة الأمراض المعدية. علاوة على ذلك ، أثبت نشاط TOP1 البشري أنه علامة حيوية فعالة لتشخيص السرطان وعلاجه18،19،23. على الرغم من أن نشاط TOP1 هو الذي يؤثر على فعالية مثبط العلاج الكيميائي26 ، إلا أنه غالبا ما يتم تقييم كمية DNA-RNA أو كمية TOP1 في الإعدادات السريرية. ويرجع ذلك إلى عدم وجود أدوات مجانية سريعة وسهلة وقائمة على الهلام يمكن أن توفر قياسا دقيقا ودقيقا لنشاط توبويزوميراز في كل إعدادات المختبر.
هنا ، يتم وصف بروتوكول لمقايسة REEAD يسمح بقياس نشاط TOP1 بطريقة خالية من الهلام. في هذا البروتوكول ، يتم تحضين TOP1 المنقى أو المستخلص الخام من الخلايا بركيزة مصممة خصيصا على شكل دمبل DNA والتي ، عند الانقسام / الربط بوساطة TOP1 يتم تحويلها إلى جزيء دائري مغلق. ثم يتم تهجين الدوائر على سطح زجاجي وتضخيمها بواسطة RCA. للسماح بسهولة الاستخدام في أداء التفاعلات التي تحدث على الشريحة ، يتم توصيل شبكة سيليكون بالزجاج ، مما يجعل الآبار الفردية حيث تحدث التفاعلات. بهذه الطريقة ، يستفيد البروتوكول من نظام متعدد الآبار – شبكة سيليكون – تسمى صانع الآبار.
تم استخدام البروتوكول للكشف عن نشاط المؤتلف TOP1 و TOP1 المستخرج من خلايا سرطان القولون والمستقيم الغدية Caco2 ، المستخدمة كمثال. علاوة على ذلك ، كمثال على REEAD لاستخدامه كأداة لفحص الأدوية ، تم استخدام البروتوكول للكشف عن تثبيط نشاط TOP1 بواسطة مثبط TOP1 المعروف CPT24,25. اقترن الفحص بطرق قراءة مختلفة – الفحص المجهري الفلوري ، الذي يعطي حساسية عالية ، وماسح ضوئي مضان ، أو تلألؤ كيميائي ، أو قياس لوني ، والتي تتطلب معدات وتدريبا أقل تخصصا. تتميز قراءات المجهر الفلوري شديدة الحساسية بحدود الحاجة إلى إعداد مجهر مضان عالي الجودة ، وموظفين مهرة ، والحصول على الصور وتحليلها بشكل يستغرق وقتا طويلا.
لهذه الأسباب ، يتم تقديم قراءة الماسح الضوئي الفلوري الذي يسمح بالحصول على وتحليل أسرع حتى لو كان ذلك على حساب الحساسية. في حالة عدم وجود ماسح ضوئي مضان ، يمكن النظر في بديلين ممتازين ، التقلؤ الكيميائي وطرق القراءة اللونية. كلتا الطريقتين سريعة وبسيطة ، ولا تتطلب معدات باهظة الثمن أو تدريبا متخصصا. في جميع تنسيقات القراءة ، تتمتع REEAD بالعديد من المزايا مقارنة بالمقايسات الحديثة ، والتي تستغرق وقتا أطول ، وتعتمد على الهلام (مع متطلبات عوامل الإقحام) ، وأقل كمية مباشرة. ومع ذلك ، هناك بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول المقدم. عند التعامل مع فحص الدواء ، يجب تحسين النقاط الزمنية وتركيز الدواء ونسبة كمية TOP1 / ركيزة الحمض النووي مقارنة بالإعدادات الموصوفة المحسنة ل CPT. يمكن التحقيق في الدواء بإجراء حضانة مسبقة مع ركيزة الحمض النووي أو الحضانة المسبقة مع إنزيم TOP1. هذا يمكن أن يعطي معلومات قيمة حول قدرة الجزيء على تثبيط TOP1 وتقديم نظرة ثاقبة لآلية عمل الدواء.
علاوة على ذلك ، إذا كنت تعاني من إشارات منخفضة أو غائبة ، فمن المرجح أن يكون هذا بسبب تحلل غير فعال للعينة الخام أو تدهور TOP1 في المستخلص بسبب الاستخدام غير السليم لمثبطات الأنزيم البروتيني. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون هذا أيضا بسبب عدم كفاية تخزين مكونات الفحص المهمة ، مثل TOP1 المؤتلف ، وبوليميراز phi29 ، والنيوكليوتيدات ، والركيزة ، والتمهيدي. أخيرا ، يجب تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة لقليل النيوكليوتيدات ، لأن هذا يؤثر بشكل كبير على أداء الفحص. عند استخدام المستخلص الخام ، يجب تحسين كفاءة استخراج العينة البيولوجية المحددة وقد تختلف كمية ونشاط TOP1 عن المثال المذكور هنا. لهذا السبب ، سيتطلب كل مستخلص خام يتم اختباره معايرة لتحديد حد اكتشاف الفحص ونطاق الحساسية عند استخدام تلك العينة المعينة. تم تحسين البروتوكول للكشف عن TOP1 البشري. يمكن قياس نشاط TOP1s حقيقية النواة الأخرى ، ولكن قد يلزم تحسين تركيز كلوريد الصوديوم ووقت الحضانة وفقا لطريقة تنقية الإنزيم ونشاط الإنزيم الأمثل. ستنتج المزيد من الركائز الدائرية عن الحضانة المطولة ، في حين أن عددا أقل من الركائز الدائرية سينتج عن الحضانة القصيرة.
بالإضافة إلى التطبيقات المقدمة ، يسمح REEAD بقياس نشاط TOP1 في المستخلصات الخام من الخزعات الصغيرة من مرضى السرطان18 ، والتنبؤ بالتأثير السام للخلايا المضاد للسرطان ل CPT في خطوط الخلايا السرطانية 20،21،22 ، وحتى الكشف عن نشاط الإنزيم في الخلايا المفردة20,21 . علاوة على ذلك ، فإن إعداد REEAD المقدم باستخدام صانع الآبار يتيح فحص الأدوية متعدد الآبار لمكتبات المركبات الاصطناعية أو الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير نسخة معدلة من مقايسة REEAD ، تسمى REEAD C / L. يتيح هذا الإعداد إجراء تحقيقات منفصلة لخطوات الانقسام والربط لتفاعل TOP127. مع REEAD C / L ، من الممكن تحديد آلية عمل مثبطات الجزيئات الصغيرة ووصفها بأنها مثبطات تحفيزية TOP1 مع تأثيرات مضادة للطفيليات محتملة28 أو كسموم TOP1 لاستخدامها في العلاج المضاد للسرطان24،25. وأخيرا، مع إعادة تصميم محددة لركائز الحمض النووي لتتناسب مع المتطلبات المختلفة (لربط الحمض النووي أو ربط الانقسام) لإنزيمات TOP1 الأخرى، تم استخدام REEAD أيضا للكشف عن الأمراض المعدية (كما في حالة المتصورة المنجلية، التي تسبب الملاريا29)، أو فيروس الليشمانيا دونوفاني وجدري القرود (البيانات غير معروضة). أو يمكن استخدامه لتحديد مركبات الجزيئات الصغيرة ذات التأثيرات المضادة للأمراض. يوفر البروتوكول المقدم للعلماء في مجال TOP1 طريقة سهلة للكشف عن نشاط الإنزيم مع القليل من التحسين أو بدونه مع إمكانية التكيف مع تطبيقات أوسع في المستقبل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا فني المختبر نوريكو ي. هانسن ، قسم البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة ، جامعة آرهوس ، على المساعدة الفنية فيما يتعلق بتنقية إنزيم Phi29 و TOP1.
Materials
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
References
- Baldwin, E. L., Osheroff, N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).
- Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).
- Ikeguchi, M., et al. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).
- Meisenberg, C., et al. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).
- Palshof, J. A., et al. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).
- Proszek, J., et al. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).
- Leppard, J. B., Champoux, J. J. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).
- Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).
- Redinbo, M. R., et al. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).
- Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M. Topoisomerase assays. Current Protocols in Pharmacology. 57 (1), 3 (2012).
- Tesauro, C., et al. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).
- Keller, J. G., et al. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).
- Christiansen, K., Westergaard, O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).
- Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , 283-299 (2018).
- Stougaard, M., et al. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).
- Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).
- Jakobsen, A. K., et al. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).
- Jakobsen, A. K., et al. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).
- Keller, J. G., et al. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).
- Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R. Enzymatic activity in single cells. Trends in Biotechnology. 29 (5), 222-230 (2019).
- Tesauro, C., et al. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240 (2020).
- Tesauro, C., et al. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).
- Pommier, Y. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).
- Bailly, C. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398 (2019).
- Petersen, K. V., et al. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255 (2021).
- García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).
- Hede, M. S., et al. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
