Ein Protokoll für den sensitiven und quantitativen Nachweis der Topoisomerase 1-Aktivität unter Verwendung des Rolling-Circle-Enhanced Enzymaktivitätsnachweis-Assays wird beschrieben. Die Methode ermöglicht den Nachweis der Topoisomerase 1-Aktivität aus gereinigten Komponenten oder Zell-/Gewebeextrakten. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen in allen Bereichen, in denen enzymatische Aktivität nachgewiesen wird.
Isotherme Amplifikationstechniken wie die Rollkreisamplifikation wurden erfolgreich zum Nachweis von Nukleinsäuren, Proteinmengen oder anderen relevanten Molekülen eingesetzt. Diese Methoden haben sich als wesentliche Alternativen zu PCR oder ELISA für klinische und Forschungsanwendungen erwiesen. Darüber hinaus reicht der Nachweis der Proteinmenge (durch Western Blot oder Immunhistochemie) oft nicht aus, um Informationen für die Krebsdiagnose zu liefern, während die Messung der Enzymaktivität einen wertvollen Biomarker darstellt. Die Messung der Enzymaktivität ermöglicht auch die Diagnose und mögliche Behandlung von durch Krankheitserreger übertragenen Krankheiten. In allen Eukaryoten sind Topoisomerasen die wichtigsten DNA-bindenden Enzyme, die an der Kontrolle des topologischen Zustands der DNA während wichtiger zellulärer Prozesse beteiligt sind und zu den wichtigen Biomarkern für die Krebsprognose und -behandlung gehören.
Im Laufe der Jahre wurden Topoisomerasen als potenzielles Ziel von Antiparasitika und Krebsmedikamenten mit Bibliotheken natürlicher und synthetischer niedermolekularer Verbindungen, die jedes Jahr untersucht werden, wesentlich untersucht. Hier wird die Rolling-Circle-Amplifikationsmethode vorgestellt, die als REEAD-Assay (Rolling Circle Enhanced Enzyme Activity Detection) bezeichnet wird und die quantitative Messung der Topoisomerase 1 (TOP1)-Aktivität auf einfache, schnelle und gelfreie Weise ermöglicht. Durch Spaltung und Ligierung eines speziell entworfenen DNA-Substrats wandelt TOP1 ein DNA-Oligonukleotid in einen geschlossenen Kreis um, der zur Vorlage für die Rollkreisamplifikation wird und ~103 Tandem-Wiederholungsrollkreisprodukte ergibt. Je nach Nukleotideinbau während der Amplifikation besteht die Möglichkeit verschiedener Auslesemethoden, von Fluoreszenz über Chemilumineszenz bis hin zu kolorimetrisch. Da jede TOP1-vermittelte Spaltungsligatur einen geschlossenen DNA-Kreis erzeugt, ist der Assay hochsensitiv und direkt quantitativ.
Topoisomerasen gehören zur Klasse der DNA-modifizierenden Enzyme und viele von ihnen haben sich als Biomarker für menschliche Krankheiten 1,2,3,4,5,6 bewährt. TOP1 ist an der Auflösung des topologischen Stresses beteiligt, der mit zellulären Prozessen wie DNA-Replikation, Gentranskription, Rekombination und chromosomaler Segregation verbundenist 7. TOP1 kann sowohl negative als auch positive Superspulen durch einen Mechanismus auflösen, der die Bildung eines vorübergehenden einzelsträngigen Bruchs in der DNA 8,9 beinhaltet. Nach der Bindung an DNA positioniert TOP1 das aktive Tyrosin (Tyr723), um einen nukleophilen Angriff auf das Phosphodiester-Rückgrat durchzuführen. Ein TOP1-DNA-Spaltungskomplex wird dann erzeugt, wobei das Enzym kovalent an das 3′-Ende des gebrochenen DNA-Strangs gebunden ist. Dadurch wird Torsionsspannung freigesetzt, indem sich das 5′-Ende des gespaltenen Strangs um den intakten Strang drehen kann. Schließlich führt die Hydroxylgruppe des 5′-Endes einen nukleophilen Angriff auf die 3′-Phosphotyrosylbindung durch. Als Ergebnis wird TOP1 freigesetzt und das DNA-Rückgrat wird wiederhergestellt8.
Mehrere Assays wurden entwickelt, um die Schritte des katalytischen TOP1-Zyklus zu untersuchen, darunter der Relaxationsassay10, der elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassay (EMSA)11,12, der DNA-Selbstmord-Spaltungs-Ligations-Assays 13,14 und der In-vivo-Enzymkomplex (ICE)-Assay15 . Diese Assays haben jedoch einige Einschränkungen, da sie von der Gelelektrophorese abhängig sind, die DNA-Interkalationsmittel erfordert, oder sie erfordern eine hochspezialisierte Ausbildung und Ausrüstung. Darüber hinaus erfordern die Assays große Mengen an gereinigtem TOP1-Enzym (im Bereich von 1 bis 5 ng für den Relaxationstest und 50 bis 200 ng für den EMSA und den Spaltungs-Ligations-Assay) oder Extrakte aus mindestens 10bis 6 Zellen, um optimal zu funktionieren. Daher wurde eine hochempfindliche Methode entwickelt, die den spezifischen Nachweis der TOP1-Aktivität in rohen biologischen Proben und auf der Ebene einzelner katalytischer Ereignisse ermöglicht, der sogenannte REEAD-Assay,16.
Hier wird ein Protokoll zum Nachweis der TOP1-Aktivität mit dem REEAD-Assay16 vorgestellt. Eine schematische Darstellung des Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein speziell entwickeltes Silikongitter wird an einem funktionalisierten Objektträger befestigt, um ein Glasobjektträger-Multiwell-Setup zu erstellen, das im Folgenden als Wellmaker bezeichnet wird (Abbildung 1A). Es folgt die Kopplung eines 5′-aminomodifizierten Primers an die funktionellen NHS-Gruppen in den Vertiefungen des Objektträgers (Abbildung 1B). Die TOP1-vermittelte Spaltungs- und Ligationsreaktion wandelt ein spezifisches DNA-Substrat in einen geschlossenen Kreis um. Das TOP1-spezifische Substrat (Abbildung 1C) faltet sich spontan zu einer Hantelform, die einen doppelsträngigen Stiel und zwei einzelsträngige Schlaufen enthält. Eine der Schlaufen ist komplementär zur oberflächenverankerten Grundierung. Die Stammregion enthält eine bevorzugte TOP1-Spaltstelle drei Basen stromaufwärts vom 3′-Ende und einen 5′-Hydroxylüberhang. Die Zirkular des Substrats kann entweder mit Zell-/Gewebeextrakt (Abbildung 1C) oder rekombinantem, gereinigtem TOP1 (Abbildung 1D) erreicht werden.
Wenn das Substrat durch TOP1 gespalten wird, wird das Enzym vorübergehend an das 3′-Ende gebunden und das Dreibasenfragment diffundiert, wodurch der 5′-Überhang zum Substrat geglüht werden kann und die TOP1-vermittelte Ligatur erleichtert wird. Die Ligatur führt zu einer Zirkularisierung des Substrats und anschließend zur Dissoziation von TOP1. Der geschlossene Kreis wird mit dem oberflächenverankerten Primer hybridisiert (Abbildung 1E) und als Vorlage für die isotherme Rollkreisamplifikation (RCA) verwendet, die durch die phi29-Polymerase vermittelt wird, die RCA mit Strangverschiebung durchführen kann, was 103 Tandem-Wiederholungsprodukte ergibt. Während des RCA-Schritts können fluoreszenzmarkierte (Abbildung 1F) oder Biotin-gekoppelte (Abbildung 1G) Nukleotide eingebaut werden17. Der Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden ermöglicht die Detektion der RCPs entweder mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenzscanner. Alternativ kann ein Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelter Antibiotin-Antikörper (Abbildung 1H) die biotinylierten Nukleotide binden und so den Nachweis der Rolled Circle Products (RCPs) ermöglichen, entweder durch verstärkte Chemilumineszenz (ECL) oder durch Umwandlung von 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) in eine nachweisbare Farbe. Die RCA folgt einer linearen Reaktionskinetik, wodurch der REEAD-Assay direkt quantitativ wird, da ein RCP eine einzelne TOP1-vermittelte Spaltungs-Ligationsreaktion darstellt. Hier wird gezeigt, dass dieser Assay verwendet werden kann, um die TOP1-Aktivität als gereinigtes rekombinantes Enzym oder aus Rohproben und als Anti-TOP1-Drogen-Screening-Tool nachzuweisen.
Topoisomerasen stellen eine Klasse von DNA-modifizierenden Enzymen dar, die hohes Forschungs- und klinisches Interesse wecken und das Ziel niedermolekularer Verbindungen mit potenzieller Wirkung bei der Krebsbehandlung oder bei der Bekämpfung von Infektionskrankheiten sind. Darüber hinaus hat sich die Aktivität von humanem TOP1 als wirksamer Biomarker für die Krebsprognose und -behandlung erwiesen18,19,23. Obwohl es die TOP1-Aktivität ist, die die Wirksamkeit eines chemotherapeutischen Inhibitors26 beeinflusst, ist es häufig die Menge der DNA-RNA oder die Menge an TOP1, die im klinischen Umfeld bewertet wird. Dies ist auf den Mangel an schnellen, einfachen und gelbasierten kostenlosen Tools zurückzuführen, die eine genaue und präzise Quantifizierung der Topoisomerase-Aktivität in jeder Laborumgebung ermöglichen können.
Hier wird ein Protokoll für den REEAD-Assay beschrieben, das die gelfreie Messung der TOP1-Aktivität ermöglicht. In diesem Protokoll wird gereinigtes TOP1 oder Rohextrakt aus Zellen mit einem speziell entwickelten DNA-Hantelsubstrat inkubiert, das bei Spaltung / Ligatur, die durch TOP1 vermittelt wird, in ein geschlossenes, kreisförmiges Molekül umgewandelt wird. Die Kreise werden dann auf einer Glasoberfläche hybridisiert und durch RCA verstärkt. Um die Durchführung von Reaktionen auf dem Objektträger zu erleichtern, ist ein Silikongitter am Glas befestigt, wodurch einzelne Vertiefungen entstehen, in denen die Reaktionen stattfinden. Auf diese Weise nutzt das Protokoll ein Multiwell-System – ein Silikongitter – namens Wellmaker.
Das Protokoll wurde verwendet, um die Aktivität von rekombinantem TOP1 und TOP1 nachzuweisen, die aus kolorektalen Adenokarzinomzellen Caco2 extrahiert wurden, als Beispiel verwendet. Darüber hinaus wurde das Protokoll als Beispiel für REEAD, das als Drogenscreening-Tool verwendet werden soll, verwendet, um die Hemmung der TOP1-Aktivität durch den bekannten TOP1-Inhibitor CPT24,25 nachzuweisen. Der Assay wurde mit verschiedenen Auslesemethoden gekoppelt – Fluoreszenzmikroskopie, die eine hohe Empfindlichkeit ergibt, und einem Fluoreszenzscanner, Chemilumineszenz oder kolorimetrisch, die weniger spezielle Ausrüstung und Training erfordern. Das hochempfindliche Auslesen des Fluoreszenzmikroskops hat die Grenzen der Notwendigkeit einer qualitativ hochwertigen Fluoreszenzmikroskopeinstellung, qualifiziertem Personal und zeitaufwändiger Bildaufnahme und -analyse.
Aus diesen Gründen wird der Fluoreszenzscanner angezeigt, der eine schnellere Erfassung und Analyse ermöglicht, auch wenn dies auf Kosten der Empfindlichkeit geht. Im Falle des Fehlens eines Fluoreszenzscanners können zwei ausgezeichnete Alternativen, Chemilumineszenz und kolorimetrische Auslesemethoden, in Betracht gezogen werden. Beide Methoden sind schnell und einfach und erfordern keine teure Ausrüstung oder spezielle Schulung. In allen Ausleseformaten hat REEAD viele Vorteile gegenüber den State-of-the-Art-Assays, die zeitaufwendiger, gelbasiert (mit den Anforderungen von Interkalationsmitteln) und weniger direkt quantitativ sind. Es gibt jedoch einige kritische Schritte in dem vorgestellten Protokoll. Bei der Durchführung des Wirkstoffscreenings sollten die Zeitpunkte, die Wirkstoffkonzentration und das Verhältnis von TOP1-Menge/DNA-Substrat im Vergleich zu den beschriebenen Einstellungen optimiert werden, die für CPT optimiert sind. Das Medikament kann untersucht werden, indem eine Präinkubation mit dem DNA-Substrat oder eine Vorinkubation mit dem TOP1-Enzym durchgeführt wird. Dies kann wertvolle Informationen über die Fähigkeit des Moleküls geben, TOP1 zu hemmen und Einblicke in den Wirkmechanismus des Arzneimittels zu geben.
Darüber hinaus ist dies bei niedrigen oder fehlenden Signalen höchstwahrscheinlich auf eine ineffiziente Lyse der Rohprobe oder einen Abbau von TOP1 im Extrakt aufgrund unsachgemäßer Verwendung von Proteaseinhibitoren zurückzuführen. Darüber hinaus kann dies auch auf eine unzureichende Lagerung der wichtigen Assay-Komponenten wie rekombinantes TOP1, phi29-Polymerase, Nukleotide, Substrat und Primer zurückzuführen sein. Schließlich sollten wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen der Oligonukleotide vermieden werden, da dies die Assay-Leistung dramatisch beeinträchtigt. Wenn Rohextrakt verwendet wird, muss die Extraktionseffizienz der spezifischen biologischen Probe optimiert werden, und die Menge und Aktivität von TOP1 kann von dem hier berichteten Beispiel abweichen. Aus diesem Grund erfordert jeder zu testende Rohextrakt eine Titration zur Identifizierung der Assay-Nachweisgrenze und des Empfindlichkeitsbereichs bei Verwendung dieser bestimmten Probe. Das Protokoll wurde für den Nachweis von humanem TOP1 optimiert. Die Aktivität anderer eukaryotischer TOP1 kann gemessen werden, aber die NaCl-Konzentration und Inkubationszeit muss möglicherweise entsprechend der Enzymreinigungsmethode und der optimalen Enzymaktivität optimiert werden. Mehr zirkularisierte Substrate resultieren aus längerer Inkubation, während weniger zirkularisierte Substrate aus verkürzter Inkubation resultieren.
Zusätzlich zu den vorgestellten Anwendungen ermöglicht REEAD die Messung der TOP1-Aktivität in Rohextrakten aus kleinen Biopsien von Krebspatienten18, die Vorhersage der zytotoxischen Antikrebswirkung von CPT in Krebszelllinien 20,21,22 und sogar den Nachweis der Enzymaktivität in einzelnen Zellen 20,21 . Darüber hinaus ermöglicht die vorgestellte REEAD-Einstellung mit dem Wellmaker ein Multiwell-basiertes Wirkstoffscreening von Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen. Darüber hinaus wurde eine modifizierte Version des REEAD-Assays namens REEAD C/L entwickelt. Dieser Aufbau ermöglicht getrennte Untersuchungen der Spaltungs- und Ligationsschritte der TOP1-Reaktion27. Mit dem REEAD C/L ist es möglich, den Wirkmechanismus von niedermolekularen Inhibitoren zu bestimmen und sie als TOP1-katalytische Inhibitoren mit potentieller antiparasitärer Wirkung28 oder als TOP1-Gifte zur Krebsbehandlung 24,25 zu charakterisieren. Schließlich wurde REEAD mit einer spezifischen Neugestaltung der DNA-Substrate, um den unterschiedlichen Anforderungen (für DNA-Bindung oder Spaltungsligatur) anderer TOP1-Enzyme gerecht zu werden, auch für den Nachweis von Infektionskrankheiten (wie im Fall von Plasmodium falciparum, das Malaria verursacht29) oder Leishmania donovani und Monkeypox virus (Daten nicht gezeigt) verwendet. Oder es kann verwendet werden, um niedermolekulare Verbindungen mit antipathogener Wirkung zu identifizieren. Das vorgestellte Protokoll bietet Wissenschaftlern im TOP1-Bereich eine einfache Methode, um Enzymaktivität mit wenig bis gar keiner Optimierung zu erkennen und mit der Möglichkeit, in Zukunft an noch breitere Anwendungen angepasst zu werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken der Labortechnikerin Noriko Y. Hansen, Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, für die technische Unterstützung in Bezug auf Phi29- und TOP1-Enzymreinigungen.
Equipment | |||
Camera for fluorescence image analysis | |||
CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
Humidity chamber with dH2O | |||
Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
Materials | |||
Cell culture | |||
Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
Trypsin | Sigma | #T4174 | |
Pen strep | Sigma | #P4300 | |
Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
FBS | Gibco | #10270106 | |
NEEA | Sigma | #M7145 | |
PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
Functionalized slides | |||
5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
DNA circles and rolling circle amplification | |||
TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
Detection of rolling circle products | |||
BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
Cover glass | |||
ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
Buffer list | |||
1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Chemicals for buffers | |||
Tris | Sigma | #T1506 | |
HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
PMSF | Sigma | #05056489001 | |
SDS | Applichem | #436143 | |
Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
DTT | Sigma | #D0632 | |
CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
BSA | Sigma | #A4503 |