粗生物学的サンプル中のトポイソメラーゼ1活性のシンプルで高速なローリングサークル増幅ベースの検出

注意: 必要なバッファー組成、機器、およびその他の材料のリストは、 材料表に記載されています。 1. 細胞培養 適当な培地で好ましい細胞を培養し、指示に従って増殖させる。一例として、20%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100単位/ mLペニシリン、および100 mg / mLストレプトマイシンを添加した最小必須培地(MEM)で、結腸直腸腺癌由来の細胞であるCaco2を増殖させます。細胞培養物を加湿インキュベーター(37°Cで5%CO2/95%空気雰囲気)に維持します。細胞を組織培養フラスコにプレートし、3日ごとに分割して細胞を70%のコンフルエントに維持します。 トリプシン処理(0.25%トリプシン、0.02TA溶液)によって70%コンフルエントフラスコから細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。 細胞ペレットをPBSに再懸濁して、細胞濃度を0.5 ×10 6 細胞/チューブに調整します。200 × g で5分間回転させ、上清を注意深く吸引します。注意: REEADに使用されるセルは、新鮮に使用し、氷上で保管する必要があります。Caco2細胞で得られた結果は最近発表されました17。このアッセイは、結腸がん、乳がん、肺がん、子宮頸がん由来の細胞18、19、20、21、22、23など、さまざまな細胞株でテストされていますが、組織、血液、唾液など、TOP1を含むすべての粗生物学的サンプルで使用できます。 2.機能化スライドの準備 カスタム設計のシリコーンアイソレータグリッドを機能化されたスライドに取り付け、それによってウェルメーカーを作ります。気泡が形成されないようにシリコンを押します( 図1Aを参照)。 5 μM 5′-アミノプライマーの混合物を1xプリントバッファーで調製します。4 μLの混合物を各ウェルに加え、ウェランカーを15°Cから25°Cの間の温度で飽和NaClとハイブリダイゼーションチャンバーに入れ、光から保護します。注:ハイブリダイゼーションチャンバーは、飽和NaClで満たされたピペットチップボックスを使用して簡単に作成できます。ハイブリダイゼーションには、最小16時間、最大72時間かかります。 図1Bの5′-アミノプライマーの配列を参照されたい。スライドはNHS基で官能化され、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの結合を可能にします。 3. 閉じた円形基板の生成 組換えTOP1または細胞抽出物を用いた閉鎖環状基質の調製。0.5 × 106 細胞の細胞ペレットを500 μLの溶解バッファーで溶解し、1,000細胞/μLの細胞密度に到達します。 氷上で10分間インキュベートします。 5 μM TOP1特異的基質(基質の配列は以下の通りである:5′-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3′)と16 μL中の組換えTOP1酵素2 μLまたは細胞抽出物2 μL(ステップ3.1.1を参照)の円混合物を調製します(ステップ3.1.1を参照)。1x TOP1反応バッファーの。注:使用する組換えTOP1の濃度は、選択した読み出し方法によって異なります(図2、図3、図4、および図5を参照)。図1CのTOP1特異的基質の配列を参照されたい。 37°Cで30分間インキュベートします( 図1C、Dを参照)。 2 μLの1%SDSを加えて反応を停止します。 薬物の存在下での閉じた円形基質の調製14 μLの1x TOP1反応バッファー中で、2 μLの5 μLのTOP1特異的基質と1 μLの100%DMSOまたは1 μLの1.6 mMカンプトテシン(CPT)の円混合物を調製します。2 μLの5 ng/μL組換えTOP1酵素を追加します。注:他の低分子化合物または薬物を使用することができる。その場合、化合物の滴定を行う必要があります。化合物がDMSO以外の溶媒に溶解している場合は、DMSOの代わりにこれをコントロールとして使用する必要があります。 37°Cで1分間インキュベートします。 2 μLの1%SDSを加えて反応を停止します。 注意: ステップ3はステップ2と並行して開始でき、円は4°Cで一晩保存できます。あるいは、ステップ4と同時にDNAサークルを調製し、直ちに使用することができる。 図1CのTOP1特異的基質の配列を参照されたい。基板は、好ましいTOP1切断部位および2つの一本鎖ループを含むダブルステム領域を有するダンベル形状に折り畳まれる。開いたダンベル基板は、TOP1を介した切断およびライゲーションによって閉じた円形基板に変換され、以下、円と呼ばれる。5′-アミノプライマーが過剰に存在するため、オープンTOP1特異的基質とクローズトTOP1特異的基質の間に競合はありません。 4.坑井メーカーのブロック 50°Cに予熱したバッファー1で満たされた5 cm x 5 cmのトレイにウェルメーカーを浸します。 ピペットを使用して、液体をウェル内に押し込み、気泡がないことを確認します。50°Cで30分間インキュベートします。 バッファー1を取り外し、dH 2 Oで2x 1分洗浄します。 手で激しく振ってください。 50°Cに予熱したバッファー2を追加します。 ウェルに気泡がないことを確認してください。50°Cで30分間インキュベートします。 dH 2 Oで2x 1分洗い、手で激しく振ってください。 70%EtOHで1分間洗浄します。手で激しく振ってください。 ウェルメーカーのセットアップを風乾させます。注意: 圧縮空気を使用してウェルを乾燥させます。あるいは、パスツールピペットを使用して空気を吹き込むことも可能です。先に進む前に、ウェルが乾いていることを確認してください。 5.サークルの坑井メーカーへのハイブリダイゼーション 対応する各ウェルに4 μLの円(ステップ3で作成)を追加します。 ウェルメーカーを湿度チャンバーに37°CのdH2Oで1時間入れます。注:湿度チャンバーは、dH2Oで満たされたピペットチップ用のボックスを使用して作成でき、あるいは、ハイブリダイゼーションは、湿度チャンバー内で25°Cで一晩行うことができる。 6.洗濯 ウェルメーカーをバッファー3で洗浄します。 バッファ 3 を削除し、バッファ 4 に置き換えます。 バッファー4を除去し、70%EtOHで洗浄します。 EtOHを取り外し、ウェルメーカーを乾燥させます。注意: すべての洗浄手順は、スライドを完全に沈めることにより、5 cm x 5 cmのトレイで1分間実行されます。ウェル内に気泡がないことを常に確認してください。 7.ローリングサークル増幅 0.2 μg/μL BSA、1ユニットのPhi29ポリメラーゼを添加した1x Phi29反応バッファー、および蛍光読み出し用の0.25 mM dNTPおよび0.0125 mM ATTO-488-dUTP、または比色/化学発光読み出し用の0.1 mM dATP、0.1 mM DTTP、0.1 mM dGTP、0.09 mM dCTP、および0.01 mM ビオチン-dCTPのRCA混合物を調製します。各ウェルに4 μLを加えます。 図1Eを参照してください。注意: RCA混合物の調製は氷上で行う必要があります。RCAに蛍光ヌクレオチドを組み込む場合は、蛍光色素を保護するために、このステップからの直接光を避けてください。 湿度チャンバー内で37°Cで2時間インキュベートします。蛍光ヌクレオチドを使用する場合は、湿度チャンバーを暗所に設置してください。図 1F,G を参照してください。 8.洗濯 化学発光または比色読み出しプロトコルの場合は、ステップ6のようにウェルメーカーを洗浄してから、ステップ11に進みます。 蛍光読み出しプロトコルの場合は、次の手順で洗浄する前にピンセットを使用してシリコングリッドを取り外します。スライドをバッファー3で10分間洗浄します。 バッファ 3 を削除し、バッファ 4 に置き換えます。5分間洗います。 バッファー4を除去し、70%EtOH中で1分間洗浄します。 EtOHを取り外し、ウェルメーカーを乾燥させます。 9. 蛍光スキャナーを用いた蛍光ローリングサークル製品の可視化 使用する蛍光色素に対応するフィルターを使用して、蛍光スキャナーでスライドをスキャンします。飽和を与えない可能な限り最大の光電子増倍管を使用してください。注:このプロトコルで画像取得に使用される蛍光スキャナーには、473 nmレーザーとFAMフィルター励起490 nm、発光520 nmが装備されています。 画像を ImageJ にインポートし、画像の種類を 8 ビット (画像 |タイプ |8 ビット)。バンドを個別に計測するには、ツールバーの長方形描画ツールを使用して計測領域を制限します。目的の領域を描画し、強度を測定します(分析|測定)。次に、最初に描画した領域を次のバンドに移動して測定します。 目的のソフトウェアでデータをプロットします。ImageJから抽出した定量化を含む代表的な画像を 図2に示します。 10. 蛍光顕微鏡による蛍光転がり円製品の可視化 EtOH耐性ペンを使用して、シリコングリッドを取り外す前にウェルの位置を描き、手順8.2のようにスライドを洗浄します。洗浄手順の後、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含まない1 μLの封入剤でスライドをマウントし、カバーガラスを追加します。カメラで視覚化できるようにするには、スライドを76 mm x 26 mmの顕微鏡スライドに接着します。 60倍の油浸対物レンズとカメラを備えた蛍光顕微鏡を使用して分析します。各サンプル/ウェルの画像を12〜15枚撮影します。 画像をImageJにインポートし、画像を積み重ねます(画像|スタック |スタックする画像)。イメージの種類を 8 ビットに変更します (Image |タイプ |8 ビット)。 しきい値を設定します(画像|調整 |しきい値)。しきい値を次のように設定します:下のバーを設定し、上のバーを調整して、正しい信号のみが赤で背景が黒になるようにします。実際の信号が消え始める前に、しきい値ができるだけ低いことを確認してください。 しきい値を設定する前に、個々の画像をスイープし、それらが画像に対応していることを確認してください。しきい値は実験ごとに変わる可能性があることに注意してください。 信号をカウントする(分析|パーティクルを解析します)。ImageJ 設定の集計フィールドがオンになっていることを確認します。結果をスプレッドシートまたはその他のソフトウェアにエクスポートして、さらにデータ処理を行います。ImageJから抽出した定量を含む代表的な画像を 図3に示します。 11. HRP結合抗ビオチン抗体とビオチン標識ローリングサークル製品のカップリング バッファー5で1:300に希釈したHRP結合抗ビオチン抗体4 μLを、5%の脱脂乳と5%のBSAを添加して各ウェルに加えます。 湿度チャンバー内で15〜25°Cで50分間インキュベートします( 図1Hを参照)。 バッファー5で3 x 3分洗浄します。 ウェルメーカーを乾かします。 12. ビオチン標識ローリングサークル製品の可視化 ECL によるビジュアライゼーション使用直前に40μLのECLルミノールと40μLのH 2 O2を混合する。各ウェルに2 μLを加えます。 CCDカメラまたはX線フィルムを使用してスライドを視覚化します。 TMBによるビジュアライゼーション手順11.4の後、シリコングリッドを取り外します。次に、スライド全体の上に400 μLのTMBを追加し、スライドを湿度チャンバーに入れます。発色まで~5-10分待ちます。発色後、スライドを70%EtOHで洗浄します。 肉眼で発色を可視化します。写真カメラまたは携帯電話でスライドの写真を撮ります。 画像を ImageJ にインポートし、画像の種類を 8 ビット (画像 |タイプ |8 ビット)。バンドを個別に計測するには、ツールバーの長方形描画ツールを使用して計測領域を制限します。目的の領域を描画し、強度を測定します(分析|測定)。次に、最初に描画した領域を次のバンドに移動して測定します。 目的のソフトウェアでデータをプロットします。ImageJから抽出した定量を含む代表的な画像を図4、図5、および図6に示します。