Akış Sitometrisine Dayalı Miyokard B Hücrelerinin Nicelleştirilmesi ve Analizi

B-lenfositler, hem adaptif hem de doğuştan gelen immün yanıtlarda önemli bir rol oynayan oldukça uzmanlaşmış bağışıklık hücreleridir¹. İki ana B hücresi popülasyonu vardır: çoğunlukla embriyonik yaşam sırasında üretilen daha küçük bir B1 hücresi popülasyonu ve yetişkin yaşamında kemik iliğinde üretilen baskın bir B2 hücresi popülasyonu¹. Kemik iliğinde olgunlaştıktan sonra, B hücreleri birincil ve ikincil lenfoid organlara göç eder. Oradan, kan damarlarından ve lenfatik damarlardan geçen lenfoid organlar arasında sürekli olarak dolaşırlar². B hücreleri, yüzeylerinde reseptör olarak işlev gören spesifik antikorları eksprese eder. B hücreleri reseptörlerine bağlanan bir antijenle karşılaştıklarında, aktive edici bir sinyal tetiklenebilir. Aktif B hücreleri ya antijenin bulunduğu dokuya göç eder ya da antikor üreten plazma hücrelerine olgunlaşabilecekleri kemik iliğine geri dönerler ^3,4.

Son zamanlarda, kalbin büyük bir B hücresi popülasyonunu barındırdığı takdir edilmektedir. Kemirgenlerde yapılan çalışmalar, B hücrelerinin embriyonik gelişim⁵ sırasında kalbi erken kolonize ettiğini ve miyokardiyal ilişkili B hücrelerinin çoğunlukla endotel 6,7’ye yapışmış intravasküler^, naif B2 hücreleri olduğunu ve küçük bir B1 hücresi yüzdesi ⁷ olduğunu göstermiştir. Hala birçok belirsizlik alanı vardır, ancak mevcut veriler B hücrelerinin hem naif kalpte hem de yaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir.

Naif murin kalbindeki çalışmalar, başlangıçta miyokard B hücrelerinin çoğunlukla endotele yapışmış intravasküler boşlukta bulunduğunu göstermiştir (murin kardiyak B hücrelerinin %>95’inin intravasküler boşlukta yer aldığı bulunmuştur). Bu B hücrelerinin, periferik kandan izole edilen dolaşımdaki B hücrelerinden farklı gen ekspresyon paternlerine sahip olduğu bulunmuştur. B hücresi eksikliği olan hayvanlardan gelen naif kalplerin analizi ve sinjenik kontroller, B hücresi olmayan hayvanların daha küçük kalplere ve daha yüksek ejeksiyon fraksiyonuna sahip olduğunu bulmuştur⁶. Tüm bu kanıtlar, B hücrelerinin miyokard büyümesini ve / veya miyokard fonksiyonunu modüle edebileceğini ve sadece interstisyel değil, aynı zamanda intravasküler B hücrelerinin de bu tür gözlemlerden sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. B hücrelerinin ayrıca miyokard yerleşik makrofajlarının fenotipini modüle ettiği bulunmuştur⁸.

Birçok çalışma, B hücrelerinin^yaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermiştir 8,9,10,11,12,13. B hücreleri, muhtemelen CXCL13-CXCR5’e bağımlı^{bir mekanizma 11,13} yoluyla yaralı kalpte geçici olarak birikir^. Oradan, B hücreleri, sitokin aracılı monosit alımını içeren çeşitli mekanizmalar yoluyla olumsuz kardiyak yeniden yapılanmayı teşvik eder ^9,12. Ek olarak, B hücreleri, çeşitli mekanizmalarla kardiyak hasarın genişlemesini ve olumsuz kardiyak yeniden şekillenmeyi teşvik edebilen kardiyak proteinlere karşı antikorlar üretebilir 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B hücreleri ayrıca IL-10 10’un salgılanması yoluyla yaralı kalp üzerinde koruyucu etkiler^{gösterebilir.}

B hücrelerinin naif ve yaralı kalpteki rolünü araştıran grupların sayısı arttıkça, miyokard B hücrelerini uygun şekilde ölçmek ve değerlendirmek ve böylece literatürde ortaya çıkmaya başlamış tutarsızlıklardan kaçınmak için paylaşılan protokolleri tanımlamak giderek daha önemli hale gelmektedir. Şimdiye kadar B hücrelerinin her ikisinin de kemirgen kalbindeki en yaygın bağışıklık hücrelerinden biri olduğu⁷ ve miyeloid hücrelerden ^26,27 veya oldukça nadir^28’den belirgin şekilde daha düşük bir prevalansta bulundukları bildirilmiştir. Benzer şekilde, birkaç grup akut iskemik miyokard hasarı 7,9,13’ten sonra miyokard B hücrelerinin sayısının arttığını tanımlamıştır^, ancak bir grup yaralı miyokard^29’un B hücrelerinin sayısında herhangi bir değişiklik olmadığını bildirmiştir. Kardiyak immün hücreler üzerinde yapılan çalışmalar nadiren perfüzyon koşulları hakkında ayrıntılı bilgi verir ve sindirim koşulları hakkında fikir birliği yoktur. Kemirgen kalbinde, B hücrelerinin büyük bir kısmı intravasküler olduğundan ve bağışıklık hücrelerinin miyokarddan ekstraksiyonu kullanılan sindirim yöntemine büyük ölçüde bağlı olduğundan, literatürde bildirilen farklılıklar organ perfüzyonu ve doku sindirimindeki farklılıkların bir sonucu olabilir.

Burada, perfüzyon ve sindirim koşullarını optimize ederek B hücresi geri kazanımının verimini en üst düzeye çıkaran ve intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücrelerinin ayrımına izin veren murin miyokard B hücrelerinin akış sitometrisine dayalı nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır⁶. Bu protokol, intravasküler ve interstisyel immün hücreleri birbirinden ayıran diğer benzer protokollerin uyarlanması ve optimizasyonudur 28,30,31.

Bu protokolde, mikrovasküler endotele yapışmış biyolojik olarak ilgili B hücrelerini çıkarmadan intravasküler boşlukta yüzen B hücrelerini ortadan kaldırmak için miyokard perfüzyonunu standartlaştırıyoruz. Ayrıca, intravasküler ile interstisyel immün hücreleri^32’yi ayırt etmek için intravenöz antikor enjeksiyonunun kullanımını tanımlayan önceki protokollere dayanarak ve B hücrelerinin yüzey belirteci B220^33’ü eksprese etmesinden yararlanarak, hayvan kurban edilmeden ve kardiyak perfüzyondan hemen önce B220’ye özgü bir antikorun intravasküler enjeksiyonu yoluyla intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücrelerinin nasıl ayırt edileceğini gösteriyoruz. Bu protokol, naif ve yaralı kalpteki miyokard B hücrelerinin analizini de dahil etmek isteyen herhangi bir bilim adamının araştırmasıyla ilgilidir. Bu protokolün yaygın olarak uygulanması, araştırma grupları arasındaki tutarsızlıkları azaltacak, intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücre havuzlarındaki değişikliklerin analizine izin verecek ve böylece kardiyak immünoloji alanındaki keşiflerin ilerlemesini destekleyecektir.

Özetle, protokol, akış sitometrisi yoluyla miyokard B hücrelerini ölçmek ve analiz etmek için optimize edilmiş bir iş akışını temsil eder ve aynı zamanda ekstravasküler boşlukta ve intravasküler boşlukta bulunan hücreleri ayırt eder.