Qui riportiamo un protocollo per la quantificazione e la differenziazione dei linfociti B miocardici in base alla loro posizione nello spazio intravascolare o endoteliale utilizzando la citometria a flusso.
Un numero crescente di prove dimostra che i linfociti B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e dell’adattamento miocardico alle lesioni. Tuttavia, la letteratura riporta dati contrastanti sulla prevalenza delle cellule B del miocardio. È stato riportato che le cellule B sono tra le cellule immunitarie più diffuse nel cuore dei roditori o per essere presenti, ma con una prevalenza marcatamente inferiore rispetto alle cellule mieloidi, o per essere piuttosto rare. Allo stesso modo, diversi gruppi hanno descritto che il numero di cellule B miocardiche aumenta dopo il danno miocardico ischemico acuto, ma un gruppo non ha riportato cambiamenti nel numero di cellule B del miocardio danneggiato. L’implementazione di un metodo condiviso e riproducibile per valutare la prevalenza delle cellule B miocardiche è fondamentale per armonizzare le osservazioni di diversi gruppi di ricerca e quindi promuovere l’avanzamento dello studio delle interazioni miocardiche a cellule B. Sulla base della nostra esperienza, le osservazioni apparentemente contrastanti riportate in letteratura derivano probabilmente dal fatto che le cellule B miocardiche murine sono per lo più intravascolari e collegate all’endotelio microvascolare. Pertanto, il numero di cellule B recuperate da un cuore murino è squisitamente sensibile alle condizioni di perfusione utilizzate per pulire l’organo e al metodo di digestione utilizzato. Qui riportiamo un protocollo ottimizzato che tiene conto di queste due variabili critiche in modo specifico. Questo protocollo consente l’analisi riproducibile basata sulla citometria a flusso del numero di cellule B miocardiche murine e consente ai ricercatori di distinguere le cellule B miocardiche extravascolari da quelle intravascolari.
I linfociti B sono cellule immunitarie altamente specializzate che svolgono un ruolo importante nelle risposte immunitarie adattative e innate1. Ci sono due popolazioni principali di cellule B: una popolazione più piccola di cellule B1 che sono per lo più prodotte durante la vita embrionale e una popolazione preponderante di cellule B2 che vengono prodotte nella vita adulta nel midollo osseo1. Dopo la maturazione nel midollo osseo, le cellule B migrano verso gli organi linfoidi primari e secondari. Da lì ricircolano continuamente tra gli organi linfoidi che viaggiano attraverso i vasi sanguigni e i vasi linfatici2. Le cellule B esprimono anticorpi specifici sulla loro superficie, che funzionano come recettori. Quando le cellule B incontrano un antigene che si lega al loro recettore, può essere attivato un segnale di attivazione. Le cellule B attivate migrano verso il tessuto in cui è stato trovato l’antigene o tornano al midollo osseo dove possono maturare in plasmacellule produttrici di anticorpi 3,4.
Recentemente, è stato apprezzato che il cuore ospita una considerevole popolazione di cellule B. Studi su roditori hanno dimostrato che le cellule B colonizzano il cuore precocemente durante lo sviluppo embrionale5 e che le cellule B associate al miocardio sono per lo più cellule B2 intravascolari e naïve che aderiscono all’endotelio6,7, con una piccola percentuale di cellule B17. Ci sono ancora molte aree di incertezza, ma i dati disponibili indicano che le cellule B svolgono un ruolo importante sia nel cuore naïve che nel contesto dell’adattamento miocardico alle lesioni.
Studi sul cuore murino naïve hanno dimostrato che al basale le cellule B miocardiche si trovano principalmente nello spazio intravascolare, aderenti all’endotelio (>95% delle cellule B cardiache murine sono risultate localizzate nello spazio intravascolare). Queste cellule B sono risultate avere modelli di espressione genica diversi da quelli delle cellule B circolanti isolate dal sangue periferico. L’analisi dei cuori naïve di animali carenti di cellule B e i controlli singeneici hanno rilevato che gli animali privi di cellule B avevano cuori più piccoli e una frazione di eiezione più elevata6. Tutte queste evidenze suggeriscono che le cellule B potrebbero modulare la crescita miocardica e/o la funzione miocardica e che non solo le cellule B interstiziali ma anche intravascolari potrebbero essere responsabili di tali osservazioni. È stato anche scoperto che le cellule B modulano il fenotipo dei macrofagi residenti nel miocardio8.
Diversi studi hanno dimostrato che le cellule B svolgono un ruolo importante nel contesto dell’adattamento miocardico alle lesioni 8,9,10,11,12,13. Le cellule B si accumulano transitoriamente nel cuore danneggiato, probabilmente attraverso un meccanismo CXCL13-CXCR5 dipendente11,13. Da lì, le cellule B promuovono il rimodellamento cardiaco avverso attraverso diversi meccanismi che includono il reclutamento di monociti mediati da citochine 9,12. Inoltre, le cellule B possono produrre anticorpi contro le proteine cardiache che possono promuovere l’estensione del danno cardiaco e il rimodellamento cardiaco avverso attraverso diversi meccanismi 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Le cellule B possono anche esercitare effetti protettivi sul cuore ferito attraverso la secrezione di IL-1010.
Man mano che cresce il numero di gruppi che studiano il ruolo delle cellule B nel cuore naïve e ferito, sta diventando sempre più importante definire protocolli condivisi per quantificare e valutare correttamente le cellule B del miocardio ed evitare così incongruenze che hanno già iniziato a comparire in letteratura. Finora le cellule B sono state infatti entrambe riportate come una delle cellule immunitarie più diffuse nel cuore dei roditori7 e per essere presenti con una prevalenza marcatamente inferiore rispetto alle cellule mieloidi26,27, o per essere piuttosto rare 28. Allo stesso modo, diversi gruppi hanno descritto che il numero di cellule B miocardiche aumenta dopo danno miocardico ischemico acuto 7,9,13, ma un gruppo non ha riportato cambiamenti nel numero di cellule B del miocardio danneggiato29. Gli studi sulle cellule immunitarie cardiache raramente forniscono dettagli sulle condizioni di perfusione e non vi è consenso sulle condizioni di digestione. Poiché nel cuore dei roditori una grande percentuale di cellule B sono intravascolari e l’estrazione delle cellule immunitarie dal miocardio dipende fortemente dal metodo di digestione utilizzato, le differenze riportate in letteratura potrebbero essere il risultato di differenze nella perfusione d’organo e nella digestione dei tessuti.
Presentato qui è un metodo dettagliato per la quantificazione basata sulla citometria a flusso delle cellule B miocardiche murine che massimizza la resa del recupero delle cellule B ottimizzando le condizioni di perfusione e digestione e consente la discriminazionedelle cellule B miocardiche intravascolari rispetto a quelle extravascolari 6. Questo protocollo è un adattamento e un’ottimizzazione di altri protocolli simili che distinguono tra cellule immunitarie intravascolari e interstiziali 28,30,31.
In questo protocollo, standardizziamo la perfusione miocardica per eliminare le cellule B che galleggiano nello spazio intravascolare senza rimuovere le cellule B biologicamente rilevanti che aderiscono all’endotelio microvascolare. Inoltre, basandosi su protocolli precedenti che hanno descritto l’uso dell’iniezione endovenosa di anticorpi per distinguere le cellule immunitarie intravascolari da quelle interstiziali32, e sfruttando il fatto che le cellule B esprimono il marcatore di superficie B22033, dimostriamo come distinguere le cellule B miocardiche intravascolari da quelle extravascolari attraverso l’iniezione intravascolare di un anticorpo specifico B220 immediatamente prima del sacrificio animale e della perfusione cardiaca. Questo protocollo è rilevante per la ricerca di qualsiasi scienziato interessato a includere l’analisi delle cellule B miocardiche nel cuore naïve e ferito. L’implementazione diffusa di questo protocollo ridurrà le incongruenze tra i gruppi di ricerca, consentirà l’analisi dei cambiamenti nei pool di cellule B miocardiche intravascolari ed extravascolari e quindi rafforzerà il progresso delle scoperte nel campo dell’immunologia cardiaca.
In sintesi, il protocollo rappresenta un flusso di lavoro ottimizzato per quantificare e analizzare le cellule B del miocardio tramite citometria a flusso e allo stesso tempo distinguere tra cellule situate nello spazio extravascolare e nello spazio intravascolare.
Un numero crescente di evidenze indica che le cellule B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e del rimodellamento/adattamento miocardico alle lesioni 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometria a flusso è uno strumento eccellente p…
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato finanziato dalle sovvenzioni NHLBI 5K08HLO145108-03 e 1R01HL160716-01 assegnate a Luigi Adamo.
Il citometro a flusso Aurora utilizzato per sviluppare questo studio è stato finanziato dal NIH Grant S10OD026859. Riconosciamo il supporto del JHU Ross Flow Cytometry Core.
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
Anesthesia Induction Chamber – Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
DNase I – 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
R 4.1.1 | The R Foundation | ||
Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |