Cuantificación basada en citometría de flujo y análisis de células B miocárdicas
Summary
Aquí presentamos un protocolo para la cuantificación y diferenciación de linfocitos B miocárdicos en función de su ubicación en el espacio intravascular o endotelial mediante citometría de flujo.
Abstract
Un creciente cuerpo de evidencia muestra que los linfocitos B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la adaptación miocárdica a la lesión. Sin embargo, la literatura informa datos contrastantes sobre la prevalencia de las células B del miocardio. Se ha informado que las células B se encuentran entre las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores o que están presentes, pero con una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides, o que son bastante raras. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado. La implementación de un método compartido y reproducible para evaluar la prevalencia de las células B miocárdicas es fundamental para armonizar las observaciones de diferentes grupos de investigación y, por lo tanto, promover el avance del estudio de las interacciones miocárdicas de las células B. Según nuestra experiencia, las observaciones aparentemente contrastantes reportadas en la literatura probablemente se derivan del hecho de que las células B miocárdicas murinas son en su mayoría intravasculares y están conectadas al endotelio microvascular. Por lo tanto, el número de células B recuperadas de un corazón murino es exquisitamente sensible a las condiciones de perfusión utilizadas para limpiar el órgano y al método de digestión utilizado. Aquí informamos de un protocolo optimizado que da cuenta de estas dos variables críticas de una manera específica. Este protocolo permite el análisis reproducible basado en citometría de flujo del número de células B miocárdicas murinas y permite a los investigadores distinguir las células B miocárdicas extravasculares de las intravasculares.
Introduction
Los linfocitos B son células inmunes altamente especializadas que desempeñan un papel importante en las respuestas inmunes adaptativas e innatas1. Hay dos poblaciones principales de células B: una población más pequeña de células B1 que se producen principalmente durante la vida embrionaria, y una población preponderante de células B2 que se producen en la vida adulta en la médula ósea1. Después de madurar en la médula ósea, las células B migran a los órganos linfoides primarios y secundarios. Desde allí recirculan continuamente entre los órganos linfoides viajando a través de los vasos sanguíneos y linfáticos2. Las células B expresan anticuerpos específicos en su superficie, que funcionan como receptores. Cuando las células B encuentran un antígeno que se une a su receptor, se puede activar una señal de activación. Las células B activadas migran al tejido donde se encontró el antígeno o regresan a la médula ósea, donde pueden madurar y convertirse en células plasmáticas productoras de anticuerpos 3,4.
Recientemente, se ha apreciado que el corazón alberga una población considerable de células B. Estudios en roedores han demostrado que las células B colonizan el corazón temprano durante el desarrollo embrionario5, y que las células B asociadas al miocardio son en su mayoría células B2 intravasculares, ingenuas, adheridas al endotelio6,7, con un pequeño porcentaje de células B17. Todavía hay muchas áreas de incertidumbre, pero los datos disponibles indican que las células B desempeñan un papel importante tanto en el corazón ingenuo como en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión.
Los estudios en el corazón murino naïve han demostrado que, al inicio del estudio, las células B miocárdicas se encuentran principalmente en el espacio intravascular, adheridas al endotelio (se encontró que el >95% de las células B cardíacas murinas se encontraban en el espacio intravascular). Se encontró que estas células B tienen patrones de expresión génica diferentes de los de las células B circulantes aisladas de la sangre periférica. El análisis de corazones ingenuos de animales deficientes en células B y controles singénicos encontró que los animales que carecían de células B tenían corazones más pequeños y una mayor fracción de eyección6. Toda esta evidencia sugiere que las células B podrían modular el crecimiento miocárdico y / o la función miocárdica, y que no solo las células B intersticiales sino también las intravasculares podrían ser responsables de tales observaciones. También se encontró que las células B modulan el fenotipo de los macrófagos residentes del miocardio8.
Varios estudios han demostrado que las células B juegan un papel importante en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión 8,9,10,11,12,13. Las células B se acumulan transitoriamente en el corazón lesionado, probablemente a través de un mecanismo dependiente de CXCL13-CXCR511,13. A partir de ahí, las células B promueven la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos que incluyen el reclutamiento de monocitos mediados por citoquinas 9,12. Además, las células B pueden producir anticuerpos contra proteínas cardíacas que pueden promover la extensión del daño cardíaco y la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Las células B también pueden ejercer efectos protectores sobre el corazón lesionado a través de la secreción de IL-1010.
A medida que crece el número de grupos que investigan el papel de las células B en el corazón ingenuo y lesionado, cada vez es más importante definir protocolos compartidos para cuantificar y evaluar adecuadamente las células B del miocardio y así evitar inconsistencias que ya han comenzado a aparecer en la literatura. Hasta ahora, se ha informado que las células B son una de las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores7 y están presentes en una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides26,27, o que son bastante raras 28. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda 7,9,13, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado29. Los estudios sobre las células inmunes cardíacas rara vez dan detalles sobre las condiciones de perfusión y no hay consenso sobre las condiciones de digestión. Dado que en el corazón de roedor una gran proporción de células B son intravasculares y la extracción de células inmunes del miocardio depende en gran medida del método de digestión utilizado, las diferencias reportadas en la literatura podrían ser el resultado de diferencias en la perfusión de órganos y la digestión de tejidos.
Aquí se presenta un método detallado para la cuantificación basada en citometría de flujo de células B miocárdicas murinas que maximiza el rendimiento de la recuperación de células B al optimizar las condiciones de perfusión y digestión y permite la discriminación de células B miocárdicas intravasculares vs. extravasculares6. Este protocolo es una adaptación y optimización de otros protocolos similares que distinguen entre células inmunes intravasculares e intersticiales 28,30,31.
En este protocolo, estandarizamos la perfusión miocárdica para eliminar las células B que flotan en el espacio intravascular sin eliminar las células B biológicamente relevantes adheridas al endotelio microvascular. Además, basándonos en protocolos previos que han descrito el uso de inyección intravenosa de anticuerpos para distinguir las células inmunes intravasculares de las intersticiales32, y aprovechando el hecho de que las células B expresan el marcador de superficie B22033, demostramos cómo distinguir las células B miocárdicas intravasculares frente a las extravasculares a través de la inyección intravascular de un anticuerpo específico B220 inmediatamente antes del sacrificio del animal y la perfusión cardíaca. Este protocolo es relevante para la investigación de cualquier científico interesado en incluir el análisis de células B miocárdicas en el corazón ingenuo y lesionado. La implementación generalizada de este protocolo reducirá las inconsistencias entre los grupos de investigación, permitirá el análisis de los cambios en los grupos de células B miocárdicas intravasculares y extravasculares y, por lo tanto, reforzará el avance de los descubrimientos en el campo de la inmunología cardíaca.
En resumen, el protocolo representa un flujo de trabajo optimizado para cuantificar y analizar las células B del miocardio a través de la citometría de flujo, y al mismo tiempo distinguir entre las células ubicadas en el espacio extravascular y el espacio intravascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un creciente cuerpo de evidencia indica que las células B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la remodelación/adaptación miocárdica a la lesión 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometría de flujo es una excelente herrami…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por las subvenciones del NHLBI 5K08HLO145108-03 y 1R01HL160716-01 otorgadas a Luigi Adamo.
El citómetro de flujo Aurora utilizado para desarrollar este estudio fue financiado por la subvención S10OD026859 de los NIH. Reconocemos el apoyo del JHU Ross Flow Cytometry Core.
Materials
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber – Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I – 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 – Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
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