Summary

Cuantificación basada en citometría de flujo y análisis de células B miocárdicas

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

Aquí presentamos un protocolo para la cuantificación y diferenciación de linfocitos B miocárdicos en función de su ubicación en el espacio intravascular o endotelial mediante citometría de flujo.

Abstract

Un creciente cuerpo de evidencia muestra que los linfocitos B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la adaptación miocárdica a la lesión. Sin embargo, la literatura informa datos contrastantes sobre la prevalencia de las células B del miocardio. Se ha informado que las células B se encuentran entre las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores o que están presentes, pero con una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides, o que son bastante raras. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado. La implementación de un método compartido y reproducible para evaluar la prevalencia de las células B miocárdicas es fundamental para armonizar las observaciones de diferentes grupos de investigación y, por lo tanto, promover el avance del estudio de las interacciones miocárdicas de las células B. Según nuestra experiencia, las observaciones aparentemente contrastantes reportadas en la literatura probablemente se derivan del hecho de que las células B miocárdicas murinas son en su mayoría intravasculares y están conectadas al endotelio microvascular. Por lo tanto, el número de células B recuperadas de un corazón murino es exquisitamente sensible a las condiciones de perfusión utilizadas para limpiar el órgano y al método de digestión utilizado. Aquí informamos de un protocolo optimizado que da cuenta de estas dos variables críticas de una manera específica. Este protocolo permite el análisis reproducible basado en citometría de flujo del número de células B miocárdicas murinas y permite a los investigadores distinguir las células B miocárdicas extravasculares de las intravasculares.

Introduction

Los linfocitos B son células inmunes altamente especializadas que desempeñan un papel importante en las respuestas inmunes adaptativas e innatas1. Hay dos poblaciones principales de células B: una población más pequeña de células B1 que se producen principalmente durante la vida embrionaria, y una población preponderante de células B2 que se producen en la vida adulta en la médula ósea1. Después de madurar en la médula ósea, las células B migran a los órganos linfoides primarios y secundarios. Desde allí recirculan continuamente entre los órganos linfoides viajando a través de los vasos sanguíneos y linfáticos2. Las células B expresan anticuerpos específicos en su superficie, que funcionan como receptores. Cuando las células B encuentran un antígeno que se une a su receptor, se puede activar una señal de activación. Las células B activadas migran al tejido donde se encontró el antígeno o regresan a la médula ósea, donde pueden madurar y convertirse en células plasmáticas productoras de anticuerpos 3,4.

Recientemente, se ha apreciado que el corazón alberga una población considerable de células B. Estudios en roedores han demostrado que las células B colonizan el corazón temprano durante el desarrollo embrionario5, y que las células B asociadas al miocardio son en su mayoría células B2 intravasculares, ingenuas, adheridas al endotelio6,7, con un pequeño porcentaje de células B17. Todavía hay muchas áreas de incertidumbre, pero los datos disponibles indican que las células B desempeñan un papel importante tanto en el corazón ingenuo como en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión.

Los estudios en el corazón murino naïve han demostrado que, al inicio del estudio, las células B miocárdicas se encuentran principalmente en el espacio intravascular, adheridas al endotelio (se encontró que el >95% de las células B cardíacas murinas se encontraban en el espacio intravascular). Se encontró que estas células B tienen patrones de expresión génica diferentes de los de las células B circulantes aisladas de la sangre periférica. El análisis de corazones ingenuos de animales deficientes en células B y controles singénicos encontró que los animales que carecían de células B tenían corazones más pequeños y una mayor fracción de eyección6. Toda esta evidencia sugiere que las células B podrían modular el crecimiento miocárdico y / o la función miocárdica, y que no solo las células B intersticiales sino también las intravasculares podrían ser responsables de tales observaciones. También se encontró que las células B modulan el fenotipo de los macrófagos residentes del miocardio8.

Varios estudios han demostrado que las células B juegan un papel importante en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión 8,9,10,11,12,13. Las células B se acumulan transitoriamente en el corazón lesionado, probablemente a través de un mecanismo dependiente de CXCL13-CXCR511,13. A partir de ahí, las células B promueven la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos que incluyen el reclutamiento de monocitos mediados por citoquinas 9,12. Además, las células B pueden producir anticuerpos contra proteínas cardíacas que pueden promover la extensión del daño cardíaco y la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Las células B también pueden ejercer efectos protectores sobre el corazón lesionado a través de la secreción de IL-1010.

A medida que crece el número de grupos que investigan el papel de las células B en el corazón ingenuo y lesionado, cada vez es más importante definir protocolos compartidos para cuantificar y evaluar adecuadamente las células B del miocardio y así evitar inconsistencias que ya han comenzado a aparecer en la literatura. Hasta ahora, se ha informado que las células B son una de las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores7 y están presentes en una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides26,27, o que son bastante raras 28. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda 7,9,13, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado29. Los estudios sobre las células inmunes cardíacas rara vez dan detalles sobre las condiciones de perfusión y no hay consenso sobre las condiciones de digestión. Dado que en el corazón de roedor una gran proporción de células B son intravasculares y la extracción de células inmunes del miocardio depende en gran medida del método de digestión utilizado, las diferencias reportadas en la literatura podrían ser el resultado de diferencias en la perfusión de órganos y la digestión de tejidos.

Aquí se presenta un método detallado para la cuantificación basada en citometría de flujo de células B miocárdicas murinas que maximiza el rendimiento de la recuperación de células B al optimizar las condiciones de perfusión y digestión y permite la discriminación de células B miocárdicas intravasculares vs. extravasculares6. Este protocolo es una adaptación y optimización de otros protocolos similares que distinguen entre células inmunes intravasculares e intersticiales 28,30,31.

En este protocolo, estandarizamos la perfusión miocárdica para eliminar las células B que flotan en el espacio intravascular sin eliminar las células B biológicamente relevantes adheridas al endotelio microvascular. Además, basándonos en protocolos previos que han descrito el uso de inyección intravenosa de anticuerpos para distinguir las células inmunes intravasculares de las intersticiales32, y aprovechando el hecho de que las células B expresan el marcador de superficie B22033, demostramos cómo distinguir las células B miocárdicas intravasculares frente a las extravasculares a través de la inyección intravascular de un anticuerpo específico B220 inmediatamente antes del sacrificio del animal y la perfusión cardíaca. Este protocolo es relevante para la investigación de cualquier científico interesado en incluir el análisis de células B miocárdicas en el corazón ingenuo y lesionado. La implementación generalizada de este protocolo reducirá las inconsistencias entre los grupos de investigación, permitirá el análisis de los cambios en los grupos de células B miocárdicas intravasculares y extravasculares y, por lo tanto, reforzará el avance de los descubrimientos en el campo de la inmunología cardíaca.

En resumen, el protocolo representa un flujo de trabajo optimizado para cuantificar y analizar las células B del miocardio a través de la citometría de flujo, y al mismo tiempo distinguir entre las células ubicadas en el espacio extravascular y el espacio intravascular.

Protocol

Todos los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron con la aprobación del IACUC en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. 1. Preparativos Prepare el búfer del sistema de control de los bienes sobre el terreno, como se describe en el cuadro 1. Asegúrese de que haya suficienteCO2 para sacrificar a los animales. Prepare el espacio de disección (coloque la almohadilla de banco y coloque l…

Representative Results

Una vez que se completa la adquisición y se recopilan todos los eventos, los datos deben analizarse de acuerdo con la práctica estándar de citometría de flujo. El enfoque del análisis variará dependiendo del objetivo individual de cada experimento. En este caso, se buscó la cuantificación de células B intravasculares y extravasculares, y se expresó como el número de células por mg de tejido. Cuando se utiliza un citómetro espectral, se recomienda comenzar el análisis con una acti…

Discussion

Un creciente cuerpo de evidencia indica que las células B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la remodelación/adaptación miocárdica a la lesión 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometría de flujo es una excelente herrami…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue financiado por las subvenciones del NHLBI 5K08HLO145108-03 y 1R01HL160716-01 otorgadas a Luigi Adamo.

El citómetro de flujo Aurora utilizado para desarrollar este estudio fue financiado por la subvención S10OD026859 de los NIH. Reconocemos el apoyo del JHU Ross Flow Cytometry Core.

Materials

Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody 101222 BioLegend 100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue QBIAP303 Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1605-0000 SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP 114-055-101 Quality Biological 0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube 1615-5500 SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips 11213810 USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips 11267810 USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430052 Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT951 ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol T48402 Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips 11208810 USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate SVPT953 ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style 352054 Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free 430290 Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer 118-156-101 Quality Biological Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 5810759005 Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 22638289 Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 22638246 Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 UPC 109153 Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber – Mouse RWD-AICMV-100 Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL 309626 BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack CMD 2613 Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody 115537 BioLegend 50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile T9009 Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940  CD USPE AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL UX-34502-46 Cole-Parmer
Collagenase 2 LS004176 Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb Y992611-AG AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP M-08-12 AirGas USA
DNase I – 40,000 U D4527 Sigma-Aldrich
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller 4430000018 Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E 30100606 Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge 5810R Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes Eppendorf
FlowJo 10.8.1 BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) Z740287 Heathrow Scientific
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] 14025076 gibco 1x
Hyaluronidase H3506 Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight 13018-14 Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL 302831 BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 M1-940-PG AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate 4033-CS150 McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance NV2201 Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] 10010023 gibco 1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody 103208 BioLegend 200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody 103132 BioLegend 100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene FB0875711YZ Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 M08-1 AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator LED-6W AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) 305122 BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) 553141 BD Becton, Dickinson and Company Biosciences 0.5 mg/mL
R 4.1.1 The R Foundation
Razor Blades 9501250000 Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet Y12244A320-AG AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets Rotor A-4-62 Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister 86.1254.001 Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape L8394 Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0 Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA MTLL230-6005 Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long CG-730-003 Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL Z683566 Millipore Sigma
Syringe pump 55-1199 (95-240) Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 9371W13 Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119835 Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable 30119827 Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. T8913 (Millipore Sigma) Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2 SI-0236 Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips 89259-946 Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" 82027-578 Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I 12620-946 Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit 423102 BioLegend

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Cite This Article
Bermea, K. C., Rousseau, S. T., Adamo, L. Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells. J. Vis. Exp. (186), e64344, doi:10.3791/64344 (2022).

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