Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Het aangeboren immuunsysteem fungeert als de eerste verdedigingslinie tijdens infectie en als reactie op steriele stimuli, zoals weefselbeschadiging en veranderingen in homeostase. Aangeboren immuunsensoren op het celoppervlak en in het cytoplasma reageren op pathogene of schade-geassocieerde moleculaire patronen (respectievelijk PAMPs of DAMPs) om ontstekingssignaleringsroutes en cellulaire reacties te activeren. Een van de belangrijkste processen van de aangeboren immuunrespons is de inductie van celdood om geïnfecteerde of beschadigde cellen te verwijderen en verdere aangeboren en adaptieve immuunresponsen te stimuleren. Geprogrammeerde celdood (PCD) is een zeer geconserveerd proces tussen soorten, wat het evolutionaire belang ervan als een aangeboren immuunmechanisme benadrukt.

Er zijn verschillende aangeboren immuun PCD-routes die in alle celtypen kunnen worden geactiveerd. Caspasen zijn een belangrijke familie van sterk geconserveerde, intracellulaire, cysteïne-afhankelijke proteasen die van cruciaal belang zijn voor veel PCD-routes, waaronder de traditioneel niet-inflammatoire apoptoseroute, evenals inflammatoire PCD-routes zoals pyroptose, necroptose en PANoptose 1,2,3,4,5 . Er zijn 11 menselijke en 10 muriene caspasen die goed gedefinieerd zijn, evenals pseudo-caspasen die functioneel kunnen zijn, en de meeste worden constitutief uitgedrukt als inactieve monomere of dimerische pro-caspasen die decolleté vereisen voor activering ^6,7. Caspasen bevatten ook belangrijke domeinen voor de rekrutering en vorming van multiproteïnecomplexen. Deze omvatten het caspase-activerings- en rekruteringsdomein (CARD), dat te vinden is in caspase-1, caspase-2, caspase-4, caspase-5, caspase-9 en caspase-11, of het death effector-domein (DED), dat wordt gevonden in caspase-8 en caspase-10. Door zowel hun proteolytische activiteit als hun vermogen om multiproteïnecomplexen te vormen, zijn caspasen kritieke aanjagers van aangeboren immuun-PCD.

De rol van caspasen in aangeboren immuun-PCD werd voor het eerst geïdentificeerd in apoptose, waarbij de initiator caspases, caspase-2, caspase-8, caspase-9 en caspase-10, de beul caspases, caspase-3, caspase-6 en caspase-7 activeren om celdood 8,9,10,11,12 te veroorzaken. Initiator caspasen kunnen worden geactiveerd door diverse signaalcascades; De extrinsieke route activeert caspase-8 door extracellulaire ligand-geïnduceerde doodsreceptorsignalering en de intrinsieke route activeert caspase-9 door de verstoring van mitochondriale integriteit¹³. Geactiveerde initiator caspasen splitsen de linker en scheiden de grote en kleine katalytische subeenheden van beul caspasen om hun actieve vormen te produceren. De caspasen van de beul splitsen vervolgens hun substraten om de cel te demonteren, wat resulteert in DNA-degradatie, membraanblebbing, nucleaire fragmentatie en het vrijkomen van apoptotische lichamen^14,15. Dit proces eindigt meestal in een niet-lytische en niet-inflammatoire vorm van celdood in combinatie met de onmiddellijke klaring van de stervende cellen door efferocytose¹⁶. Defecten in efferocytose of een gebrek aan fagocytische cellen kunnen echter leiden tot de accumulatie van apoptotische cellen, die vervolgens lytische en inflammatoire celdood ondergaan^17,18.

De inflammatoire caspasen, waaronder caspase-1 (mens en muis), caspase-4 en caspase-5 (menselijk) en caspase-11 (muis), zijn ontdekt te worden geactiveerd tijdens een vorm van inflammatoir aangeboren immuun PCD (III-PCD) genaamd pyroptose. Caspase-1-activering is geassocieerd met de vorming van inflammasomen, multiproteïnecomplexen die een cytosolische aangeboren immuunsensor, een adaptermolecuul (apoptose-geassocieerd speck-achtig eiwit met een CARD [ASC]) en caspase-1 bevatten. De vorming van dit complex stelt caspase-1 in staat om nabijheidsgemedieerde autoproteolyse te ondergaan om zijn actieve vorm vrij te geven, die doelsubstraten kan splitsen, waaronder de pro-inflammatoire cytokines interleukine (IL) -1β en IL-18 en het porievormende molecuul gasdermine D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, caspase-4 en caspase-5 kunnen GSDMD ook activeren zonder de stroomopwaartse vorming van het inflammasoom na het detecteren van PAMP’s zoals lipopolysaccharide (LPS)^19,20. Deze caspasen ondergaan dimerisatie gevolgd door oligomerisatie en zelfsplitsing voor activering na binding aan cytosolisch LPS, wat leidt tot niet-canonieke inflammasoomactivering^24,25,26 en caspase-1 activering op een celintrinsieke manier om IL-1β en IL-18 rijping²⁰ te induceren. De rijping en afgifte van deze pro-inflammatoire cytokines karakteriseren deze caspasen als ‘inflammatoir’. Bovendien is gebleken dat de apoptotische caspase-8 zich lokaliseert naar het inflammasoom, waardoor een verband wordt gelegd tussen apoptotische en pyroptotische processen. Studies hebben aangetoond dat de apoptotische caspase-8 ook van cruciaal belang is voor het reguleren van een andere vorm van PCD genaamd necroptose. Het verlies van caspase-8 resulteert in spontane receptor-interagerende serine-threonine kinase 3 (RIPK3)-gemedieerde gemengde lineage kinase domein-like pseudokinase (MLKL) activering om de III-PCD route van necroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35 aan te sturen.

Hoewel caspasen historisch zijn geclassificeerd als “apoptotisch” of “inflammatoir” op basis van het type celdood dat ze initiëren, suggereert groeiend bewijs dat er uitgebreide overspraak is tussen de aangeboren immuun-PCD-routes door caspasen ^3,4. Bijvoorbeeld, de inflammatoire caspase-1 van inflammasomen splitst de apoptotische caspase-7 op zijn canonieke activeringsplaats³⁴. Caspase-1 activering kan ook leiden tot de splitsing van apoptotische substraten zoals poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1)³⁶. In cellen zonder GSDMD kan caspase-1 ook caspase-3^37,38 splijten. Bovendien kan de canoniek apoptotische caspase-3 gasdermin E (GSDME) splitsen om PCD^17,18 te induceren en verwerkt ook GSDMD in een inactieve vorm⁴⁰. Verder is caspase-8 rekrutering voor het inflammasoomcomplex waargenomen 39,40,41,42,43,44,45^, en caspase-8 is een belangrijke regulator van canonieke en niet-canonieke inflammasoomactivatie ³⁹. Er zijn ook overlappende en redundante rollen voor caspase-8 en caspase-1 in veel ontstekingsaandoeningen, en aangeboren immuun-PCD gekenmerkt door de activering van pyroptotische, apoptotische en necroptotische componenten komt voor in het ziektespectrum 39,46,47,48,49,50.

Op basis van deze overspraak tussen inflammatoire en apoptotische caspasen werd een belangrijke kloof in het mechanistische begrip van aangeboren immuniteit en PCD geïdentificeerd, wat leidde tot de ontdekking van PANoptose. PANoptose is een unieke vorm van III-PCD die wordt geactiveerd als reactie op pathogenen, PAMP’s, DAMP’s en veranderingen in homeostase en wordt gereguleerd door PANoptosomen – veelzijdige macromoleculaire complexen die componenten van andere celdoodroutes integreren 44,50,51,52,53,54,55 . De totaliteit van de biologische effecten in PANoptose kan niet individueel worden verklaard door pyroptose, apoptose of necroptose alleen 3,4,35,36,39,46,47,48, aangezien PANoptose wordt gekenmerkt door de activering van meerdere caspasen, waaronder caspase-1, caspase-11, caspase-8, caspase-9, caspase-3 en/of caspase-7^, afhankelijk van de context 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose is in toenemende mate betrokken bij infectie- en ontstekingsziekten, evenals bij kankers en kankertherapieën 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,^54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Gezien de essentiële rol van caspasen in celdoodroutes, waaronder apoptose, pyroptose, necroptose en PANoptose, is het belangrijk om technieken te ontwikkelen om hun activering te karakteriseren en de volledige complexiteit van de PCD-routes te begrijpen. Het protocol beschrijft hier een methode om cellen te stimuleren en de daaropvolgende activering van caspasen te meten (figuur 1). Deze methode maakt gebruik van de proteolytische splitsing van caspasen, die over het algemeen nodig is voor hun activering, als een middel om ze te bestuderen. Door middel van western blotting kunnen de eiwitgroottes worden bepaald, waardoor de inactieve pro-caspasen en hun geactiveerde, gesplitste vormen duidelijk kunnen worden gevisualiseerd en gedifferentieerd.

De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn 1) het vermogen om de activering van meerdere caspasen parallel van een enkele populatie van endogene cellen te beoordelen om pcd-activering nauwkeuriger te bepalen en 2) het gebruik van relatief eenvoudige laboratoriumtechnieken die geen uitgebreide training of dure apparatuur vereisen. Eerdere protocollen hebben westerse blotting, fluorescerende reporters of antilichaamkleuring gebruikt om caspase-activering in kweeksupernatanten, cel- en weefsellysaten, hele cellen via microscopie en in vivo 67,68,69,70,71 te controleren, maar deze technieken controleren over het algemeen slechts één of twee caspasen in een monster. Bovendien, terwijl synthetische peptidesubstraten die caspasesplitsingsplaatsen bevatten die fluoresceren bij splitsing zijn gebruikt om caspase-activering in cel- of weefsellysaten te controleren⁶⁹, kunnen deze substraten vaak door meer dan één caspase worden gesplitst, waardoor het moeilijk is om de specifieke activering van individuele caspasen in dit systeem te bepalen. Bovendien stelt het gebruik van western blotting in plaats van het gebruik van fluorescerende reporters of andere op tags gebaseerde methoden onderzoekers in staat om endogene cellen te gebruiken in plaats van specifieke cellijnen te maken met reportergenen. Er zijn meerdere voordelen aan het gebruik van endogene cellen, waaronder het feit dat veel vereeuwigde cellijnen een tekort hebben aan belangrijke celdoodmoleculen^72,73, wat de resultaten zou kunnen beïnvloeden. Bovendien maakt het gebruik van endogene cellen de evaluatie van verschillende celtypen mogelijk, zoals macrofagen, epitheelcellen en endotheelcellen, in plaats van een enkele afstamming. Western blotting is ook een relatief eenvoudige en kosteneffectieve techniek die kan worden uitgevoerd in laboratoria over de hele wereld zonder de noodzaak van grote, dure apparatuur of gecompliceerde opstellingen.

Dit protocol is breed toepasbaar in de biologie om zowel de celdoodafhankelijke als celdoodonafhankelijke functies van caspasen te begrijpen, inclusief hun steigerrollen en functies in andere ontstekingssignaleringsroutes⁷⁴. Het toepassen van deze methode maakt een uniforme aanpak mogelijk in de studie van aangeboren immuun-PCD-routes en ontstekingssignalering tussen ziekten en aandoeningen, en dit protocol kan worden gebruikt om kritieke regulerende processen en mechanistische verbindingen te identificeren die de ontwikkeling van toekomstige therapeutische strategieën zullen informeren.