Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

El sistema inmune innato actúa como la primera línea de defensa durante la infección y en respuesta a estímulos estériles, como lesiones tisulares y alteraciones en la homeostasis. Los sensores inmunes innatos en la superficie celular y en el citoplasma responden a patrones moleculares asociados a patógenos o daños (PAMP o DAMP, respectivamente) para desencadenar vías de señalización inflamatoria y respuestas celulares. Uno de los procesos clave de la respuesta inmune innata es la inducción de la muerte celular para eliminar las células infectadas o dañadas e impulsar más respuestas inmunes innatas y adaptativas. La muerte celular programada (PCD) es un proceso altamente conservado en todas las especies, destacando su importancia evolutiva como mecanismo inmune innato.

Hay varias vías innatas inmunes de PCD que pueden activarse en todos los tipos de células. Las caspasas son una familia clave de proteasas altamente conservadas, intracelulares y dependientes de cisteína que son críticas en muchas vías de PCD, incluida la vía de apoptosis tradicionalmente no inflamatoria, así como las vías inflamatorias de PCD como piroptosis, necroptosis y PANoptosis 1,2,3,4,5 . Hay 11 caspasas humanas y 10 murinas que están bien definidas, así como pseudo-caspasas que pueden ser funcionales, y la mayoría se expresan constitutivamente como pro-caspasas monoméricas o diméricas inactivas que requieren escisión para la activación ^6,7. Las caspasas también contienen dominios importantes para el reclutamiento y la formación de complejos multiproteicos. Estos incluyen el dominio de activación y reclutamiento de caspasas (CARD), que se puede encontrar en caspasa-1, caspasa-2, caspasa-4, caspasa-5, caspasa-9 y caspasa-11, o el dominio efector de muerte (DED), que se encuentra en caspasa-8 y caspasa-10. A través de su actividad proteolítica y su capacidad para formar complejos multiproteicos, las caspasas son impulsores críticos de la PCD inmune innata.

El papel de las caspasas en la PCD inmune innata se identificó por primera vez en la apoptosis, donde las caspasas iniciadoras, caspasa-2, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-10, activan las caspasas verdugo, caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7, para conducir a la muerte celular 8,9,10,11,12. Las caspasas del iniciador pueden activarse mediante diversas cascadas de señalización; La vía extrínseca activa la caspasa-8 a través de la señalización del receptor de muerte inducida por ligandos extracelulares, y la vía intrínseca activa la caspasa-9 a través de la interrupción de la integridad mitocondrial¹³. Las caspasas iniciadoras activadas escinden el enlazador separando las subunidades catalíticas grandes y pequeñas de las caspasas ejecutoras para producir sus formas activas. Las caspasas verdugos luego escinden sus sustratos para desmontar la célula, lo que resulta en la degradación del ADN, el blebbing de la membrana, la fragmentación nuclear y la liberación de cuerpos apoptóticos^14,15. Este proceso típicamente termina en una forma no lítica y no inflamatoria de muerte celular cuando se combina con la eliminación inmediata de las células moribundas por eferocitosis¹⁶. Sin embargo, los defectos en la eferocitosis o la falta de células fagocíticas pueden conducir a la acumulación de células apoptóticas, que luego sufren la muerte celular lítica e inflamatoria^17,18.

Se ha descubierto que las caspasas inflamatorias, incluidas la caspasa-1 (humana y ratón), la caspasa-4 y la caspasa-5 (humana) y la caspasa-11 (ratón), se activan durante una forma de PCD INMUNE INNATA INFLAMATORIA (III-PCD) llamada piroptosis. La activación de la caspasa-1 se asocia con la formación de inflamasomas, que son complejos multiproteicos que contienen un sensor inmune innato citosólico, una molécula adaptadora (proteína moteada asociada a la apoptosis que contiene una CARD [ASC]) y caspasa-1. La formación de este complejo permite que la caspasa-1 se someta a una autoproteólisis mediada por proximidad para liberar su forma activa, que puede escindir sustratos diana incluyendo las citoquinas proinflamatorias interleucina (IL)-1β e IL-18 y la molécula formadora de poros gasdermina D (GSDMD)19,20,21,22,23 . La caspasa-11, la caspasa-4 y la caspasa-5 también pueden activar la GSDMD sin la formación aguas arriba del inflamasoma después de detectar PAMPs como el lipopolisacárido (LPS)^19,20. Estas caspasas sufren dimerización seguida de oligomerización y autoescisión para la activación al unirse a LPS citosólico, lo que conduce a la activación no canónica del inflamasoma 24,25,26 y la activación de la caspasa-1 de manera intrínseca celular para inducir la maduración de IL-1β e IL-18 ²⁰. La maduración y liberación de estas citoquinas proinflamatorias caracterizan a estas caspasas como “inflamatorias”. Además, se ha encontrado que la caspasa-8 apoptótica se localiza en el inflamasoma, proporcionando un vínculo entre los procesos apoptóticos y piroptóticos. Los estudios han encontrado que la caspasa-8 apoptótica también es crítica para regular otra forma de PCD llamada necroptosis. La pérdida de caspasa-8 da como resultado la activación espontánea de la serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por el receptor de serina-treonina quinasa 3 (RIPK3) mediada por la pseudoquinasa de linaje mixto (MLKL) para impulsar la vía III-PCD de necroptosis 27,28,29,30,31,32,33,34,35.

Mientras que las caspasas han sido históricamente clasificadas como “apoptóticas” o “inflamatorias” en función del tipo de muerte celular que inician, la creciente evidencia sugiere que existe una amplia diafonía entre las vías innatas inmunes de PCD a través de caspasas ^3,4. Por ejemplo, la caspasa-1 inflamatoria de los inflamasomas escinde la caspasa-7 apoptótica en su sitio de activación canónica³⁴. La activación de la caspasa-1 también puede conducir a la escisión de sustratos apoptóticos como la poli(ADP-ribosa) polimerasa 1 (PARP1)³⁶. En las células que carecen de GSDMD, la caspasa-1 también puede escindir la caspasa-3^37,38. Además, la caspasa-3 canónicamente apoptótica puede escindir la gasdermina E (GSDME) para inducir PCD^17,18 y también procesa GSDMD en una forma inactiva⁴⁰. Además, se ha observado el reclutamiento de caspasa-8 para el complejo inflamasoma 39,40,41,42,43,44,45^, y la caspasa-8 es un regulador clave de la activación del inflamasoma canónico y no canónico ³⁹. También hay roles superpuestos y redundantes para la caspasa-8 y la caspasa-1 en muchas condiciones inflamatorias, y la PCD inmune innata caracterizada por la activación de componentes piroptóticos, apoptóticos y necroptóticos ocurre en todo el espectro de la enfermedad 39,46,47,48,49,50.

Sobre la base de esta diafonía entre las caspasas inflamatorias y apoptóticas, se identificó una brecha clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y la PCD, lo que llevó al descubrimiento de la PANoptosis. PANoptosis es una forma única de III-PCD que se activa en respuesta a patógenos, PAMP, DAMP y alteraciones en la homeostasis y está regulada por PANoptosomas, complejos macromoleculares multifacéticos que integran componentes de otras vías de muerte celular 44,50,51,52,53,54,55 . La totalidad de los efectos biológicos en la PANoptosis no pueden explicarse individualmente por piroptosis, apoptosis o necroptosis solas 3,4,35,36,39,46,47,48, ya que la PANoptosis se caracteriza por la activación de múltiples caspasas, incluyendo caspasa-1, caspasa-11, caspasa-8, caspasa-9, caspasa-3 y/o caspasa-7^, dependiendo del contexto 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . La PANoptosis ha sido cada vez más implicada en enfermedades infecciosas e inflamatorias, así como en cánceres y terapias contra el cáncer 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,^54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Dado el papel esencial de las caspasas a través de las vías de muerte celular, incluso en la apoptosis, la piroptosis, la necroptosis y la PANoptosis, es importante desarrollar técnicas para caracterizar su activación y comprender toda la complejidad de las vías de PCD. El protocolo aquí detalla un método para estimular las células y medir la activación posterior de las caspasas (Figura 1). Este método aprovecha la escisión proteolítica de las caspasas, que generalmente se requiere para su activación, como un medio para estudiarlas. A través de Western blotting, se pueden determinar los tamaños de las proteínas, lo que permite la visualización clara y la diferenciación de las pro-caspasas inactivas y sus formas activadas y escindidas.

Las principales ventajas de este protocolo son 1) su capacidad para evaluar la activación de múltiples caspasas en paralelo de una sola población de células endógenas para determinar con mayor precisión la activación de PCD y 2) el uso de técnicas de laboratorio relativamente simples que no requieren una capacitación extensa o equipos costosos. Los protocolos anteriores han utilizado Western blotting, reporteros fluorescentes o tinción de anticuerpos para monitorear la activación de caspasas en sobrenadantes de cultivo, lisados celulares y tisulares, células enteras mediante microscopía e in vivo 67,68,69,70,71^, pero estas técnicas generalmente solo monitorean una o dos caspasas en una muestra. Además, mientras que los sustratos peptídicos sintéticos que contienen sitios de escisión de caspasa que fluorescen sobre la escisión se han utilizado para monitorear la activación de caspasas en lisados celulares o tisulares⁶⁹, estos sustratos a menudo pueden ser escindidos por más de una caspasa, lo que dificulta determinar la activación específica de caspasas individuales en este sistema. Además, el uso de Western blot en lugar del uso de reporteros fluorescentes u otros métodos basados en etiquetas permite a los investigadores usar células endógenas en lugar de crear líneas celulares específicas con genes reporteros. El uso de células endógenas tiene múltiples ventajas, incluido el hecho de que muchas líneas celulares inmortalizadas son deficientes en moléculas clave de muerte celular^72,73, lo que podría afectar los resultados. Además, el uso de células endógenas permite la evaluación de diversos tipos de células, como macrófagos, células epiteliales y células endoteliales, en lugar de un solo linaje. Western blot también es una técnica relativamente simple y rentable que se puede llevar a cabo en laboratorios de todo el mundo sin la necesidad de equipos grandes y costosos o configuraciones complicadas.

Este protocolo es ampliamente aplicable en toda la biología para comprender las funciones dependientes de la muerte celular e independientes de la muerte celular de las caspasas, incluidas sus funciones de andamiaje y funciones en otras vías de señalización inflamatoria⁷⁴. La aplicación de este método permite un enfoque unificado en el estudio de las vías innatas inmunes de PCD y la señalización inflamatoria a través de enfermedades y afecciones, y este protocolo se puede utilizar para identificar procesos regulatorios críticos y conexiones mecanicistas que informarán el desarrollo de futuras estrategias terapéuticas.