Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Das angeborene Immunsystem fungiert als erste Verteidigungslinie während einer Infektion und als Reaktion auf sterile Reize wie Gewebeverletzungen und Veränderungen der Homöostase. Angeborene Immunsensoren auf der Zelloberfläche und im Zytoplasma reagieren auf pathogen- oder schädigungsassoziierte molekulare Muster (PAMPs bzw. DAMPs), um entzündliche Signalwege und zelluläre Reaktionen auszulösen. Einer der Schlüsselprozesse der angeborenen Immunantwort ist die Induktion des Zelltods, um infizierte oder beschädigte Zellen zu entfernen und weitere angeborene und adaptive Immunantworten voranzutreiben. Der programmierte Zelltod (PCD) ist ein hochkonservierter Prozess über Spezies hinweg, was seine evolutionäre Bedeutung als angeborener Immunmechanismus unterstreicht.

Es gibt mehrere angeborene Immun-PCD-Signalwege, die in allen Zelltypen aktiviert werden können. Caspasen sind eine Schlüsselfamilie hochkonservierter, intrazellulärer, Cystein-abhängiger Proteasen, die für viele PCD-Signalwege, einschließlich des traditionell nicht-inflammatorischen Apoptosewegs sowie entzündlicher PCD-Signalwege wie Pyroptose, Nekroptose und PANoptose^{kritisch sind} 1,2,3,4,5 . Es gibt 11 humane und 10 murine Caspasen, die gut definiert sind, sowie Pseudo-Caspasen, die funktionell sein können, und die meisten werden konstitutiv als inaktive monomere oder dimere Pro-Caspasen exprimiert, die eine Spaltung zur Aktivierung erfordern ^6,7. Caspasen enthalten auch wichtige Domänen für die Rekrutierung und Bildung von Multiproteinkomplexen. Dazu gehören die Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne (CARD), die in Caspase-1, Caspase-2, Caspase-4, Caspase-5, Caspase-9 und Caspase-11 zu finden ist, oder die Todeseffektordomäne (DED), die in Caspase-8 und Caspase-10 zu finden ist. Sowohl durch ihre proteolytische Aktivität als auch durch ihre Fähigkeit, Multiproteinkomplexe zu bilden, sind Caspasen entscheidende Treiber der angeborenen Immun-PCD.

Die Rolle von Caspasen bei der angeborenen Immun-PCD wurde erstmals in der Apoptose identifiziert, wo die Initiator-Caspasen Caspase-2, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-10 die Henker-Caspasen Caspase-3, Caspase-6 und Caspase-7 aktivieren, um den Zelltod^{zu beschleunigen} 8,9,10,11,12. Initiator-Caspasen können durch verschiedene Signalkaskaden aktiviert werden; Der extrinsische Signalweg aktiviert Caspase-8 durch extrazelluläre Liganden-induzierte Todesrezeptor-Signalgebung, und der intrinsische Signalweg aktiviert Caspase-9 durch die Störung der mitochondrialen Integrität¹³. Aktivierte Initiator-Caspasen spalten den Linker und trennen die großen und kleinen katalytischen Untereinheiten von Henker-Caspasen, um ihre aktiven Formen zu erzeugen. Die Henker-Caspasen spalten dann ihre Substrate, um die Zelle zu zerlegen, was zu DNA-Abbau, Membranblasen, Kernfragmentierung und der Freisetzung apoptotischer Körper führt^14,15. Dieser Prozess endet typischerweise in einer nicht-lytischen und nicht-entzündlichen Form des Zelltods, wenn er mit der sofortigen Beseitigung der sterbenden Zellen durch Efferozytose^{gekoppelt ist 16}. Defekte in der Efferozytose oder ein Mangel an phagozytischen Zellen können jedoch zur Anhäufung von apoptotischen Zellen führen, die dann einen lytischen und entzündlichen Zelltod durchlaufen^17,18.

Es wurde entdeckt, dass die entzündlichen Caspasen, einschließlich Caspase-1 (Mensch und Maus), Caspase-4 und Caspase-5 (Mensch) und Caspase-11 (Maus), während einer Form der entzündlichen angeborenen Immun-PCD (III-PCD) aktiviert werden, die als Pyroptose bezeichnet wird. Die Caspase-1-Aktivierung ist mit der Bildung von Inflammasomen verbunden, bei denen es sich um Multiproteinkomplexe handelt, die einen zytosolischen angeborenen Immunsensor, ein Adaptermolekül (Apoptose-assoziiertes speckartiges Protein, das eine CARD [ASC] enthält) und Caspase-1 enthalten. Die Bildung dieses Komplexes ermöglicht es Caspase-1, eine Proximity-vermittelte Autoproteolyse zu durchlaufen, um seine aktive Form freizusetzen, die Zielsubstrate spalten kann, einschließlich der proinflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-1β und IL-18 und des porenbildenden Moleküls Gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . Caspase-11, Caspase-4 und Caspase-5 können GSDMD auch aktivieren, ohne dass das Inflammasom stromaufwärts gebildet wird, nachdem PAMPs wie Lipopolysaccharid (LPS) erkannt ^wurden19,20. Diese Caspasen durchlaufen eine Dimerisierung, gefolgt von einer Oligomerisierung und Selbstspaltung zur Aktivierung bei Bindung an zytosolisches LPS, was zu einer nicht-kanonischen Inflammasom-Aktivierung 24,25,26 und einer Caspase-1-Aktivierung in zellintrinsischer Weise führt, um die IL-1β- und IL-18-Reifung zu induzieren ²⁰. Die Reifung und Freisetzung dieser entzündungsfördernden Zytokine charakterisieren diese Caspasen als “entzündlich”. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die apoptotische Caspase-8 auf dem Inflammasom lokalisiert ist, was eine Verbindung zwischen apoptotischen und pyroptotischen Prozessen herstellt. Studien haben gezeigt, dass die apoptotische Caspase-8 auch für die Regulierung einer anderen Form der PCD, der Nekroptose, entscheidend ist. Der Verlust von Caspase-8 führt zu einer spontanen Rezeptor-interagierenden Serin-Threonin-Kinase 3 (RIPK3)-vermittelten Mixed-Lineage-Kinase-Domänen-ähnlichen Pseudokinase (MLKL)-Aktivierung, um den III-PCD-Weg der Nekroptose 27,28,29,30,31,32,33,34,35 anzutreiben.

Während Caspasen in der Vergangenheit aufgrund der Art des Zelltods, den sie auslösen, als “apoptotisch” oder “entzündlich” eingestuft wurden, deuten immer mehr Hinweise darauf hin, dass es durch Caspasen ein umfangreiches Übersprechen zwischen den angeborenen immunen PCD-Signalwegen gibt ^3,4. Zum Beispiel spaltet die inflammatorische Caspase-1 aus Inflammasomen die apoptotische Caspase-7 an ihrer kanonischen Aktivierungsstelle³⁴. Die Caspase-1-Aktivierung kann auch zur Spaltung von apoptotischen Substraten wie der Poly(ADP-Ribose)-Polymerase 1 (PARP1)³⁶ führen. In Zellen, denen GSDMD fehlt, kann Caspase-1 auch Caspase-3 spalten^37,38. Zusätzlich kann die kanonisch apoptotische Caspase-3 Gasdermin E (GSDME) spalten, um PCD^17,18 zu induzieren^, und verarbeitet auch GSDMD in eine inaktive Form⁴⁰. Darüber hinaus wurde eine Caspase-8-Rekrutierung für den Inflammasom-Komplex beobachtet 39,40,41,42,43,44,45, und Caspase-8 ist ein Schlüsselregulator der kanonischen und nicht-kanonischen Inflammasom-Aktivierung ³⁹. Es gibt auch überlappende und redundante Rollen für Caspase-8 und Caspase-1 bei vielen entzündlichen Erkrankungen, und die angeborene Immun-PCD, die durch die Aktivierung von pyroptotischen, apoptotischen und nekrototischen Komponenten gekennzeichnet ist, tritt im gesamten Krankheitsspektrum^auf 39,46,47,48,49,50.

Basierend auf dieser Wechselwirkung zwischen entzündlichen und apoptotischen Caspasen wurde eine Schlüssellücke im mechanistischen Verständnis der angeborenen Immunität und der PCD identifiziert, die zur Entdeckung der PANoptose führte. PANoptose ist eine einzigartige Form der III-PCD, die als Reaktion auf Krankheitserreger, PAMPs, DAMPs und Veränderungen der Homöostase aktiviert wird und durch PANoptosomen reguliert wird – facettenreiche makromolekulare Komplexe, die Komponenten aus anderen Zelltodwegen integrieren 44,50,51,52,53,54,55 . Die Gesamtheit der biologischen Wirkungen bei der PANoptose kann nicht allein durch Pyroptose, Apoptose oder Nekroptose allein erklärt werden 3,4,35,36,39,46,47,48, da die PANoptose durch die Aktivierung mehrerer Caspasen gekennzeichnet ist, einschließlich Caspase-1, Caspase-11, Caspase-8, Caspase-9, Caspase-3 und/oder Caspase-7^, je nach Kontext 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptose wird zunehmend mit Infektions- und Entzündungskrankheiten sowie mit Krebs und Krebstherapien in Verbindung gebracht 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,^54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

Angesichts der essentiellen Rolle von Caspasen in Zelltodwegen, einschließlich Apoptose, Pyroptose, Nekroptose und PANoptose, ist es wichtig, Techniken zu entwickeln, um ihre Aktivierung zu charakterisieren und die volle Komplexität der PCD-Signalwege zu verstehen. Das Protokoll beschreibt hier eine Methode zur Stimulation von Zellen und zur Messung der anschließenden Aktivierung von Caspasen (Abbildung 1). Diese Methode nutzt die proteolytische Spaltung von Caspasen, die im Allgemeinen für ihre Aktivierung erforderlich ist, um sie zu untersuchen. Durch Western Blot können die Proteingrößen bestimmt werden, was eine klare Visualisierung und Differenzierung von inaktiven Pro-Caspasen und ihren aktivierten, gespaltenen Formen ermöglicht.

Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind 1) seine Fähigkeit, die Aktivierung mehrerer Caspasen parallel aus einer einzigen Population endogener Zellen zu beurteilen, um die PCD-Aktivierung genauer zu bestimmen, und 2) die Verwendung relativ einfacher Labortechniken, die keine umfangreiche Schulung oder teure Ausrüstung erfordern. Frühere Protokolle haben Western Blotting, Fluoreszenzreporter oder Antikörperfärbung verwendet, um die Caspase-Aktivierung in Kulturüberständen, Zell- und Gewebelysaten, ganzen Zellen durch Mikroskopie und in vivo 67,68,69,70,71 zu überwachen^, aber diese Techniken überwachen im Allgemeinen nur ein oder zwei Caspasen in einer Probe. Während synthetische Peptidsubstrate, die Caspase-Spaltstellen enthalten, die bei der Spaltung fluoreszieren, zur Überwachung der Caspase-Aktivierung in Zell- oder Gewebelysaten⁶⁹ verwendet wurden, können diese Substrate oft von mehr als einer Caspase gespalten werden, was es schwierig macht, die spezifische Aktivierung einzelner Caspasen in diesem System zu bestimmen. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Western Blot anstelle der Verwendung von fluoreszierenden Reportern oder anderen Tag-basierten Methoden den Forschern, endogene Zellen zu verwenden, anstatt spezifische Zelllinien mit Reportergenen zu erzeugen. Die Verwendung endogener Zellen hat mehrere Vorteile, einschließlich der Tatsache, dass viele immortalisierte Zelllinien einen Mangel an Schlüsselmolekülen für den Zelltod^{aufweisen 72,73,} was die Ergebnisse beeinflussen könnte. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung endogener Zellen die Bewertung verschiedener Zelltypen wie Makrophagen, Epithelzellen und Endothelzellen anstelle einer einzelnen Linie. Western Blot ist auch eine relativ einfache und kostengünstige Technik, die in Labors auf der ganzen Welt durchgeführt werden kann, ohne dass große, teure Geräte oder komplizierte Setups erforderlich sind.

Dieses Protokoll ist in der gesamten Biologie weit verbreitet, um sowohl die zelltodabhängigen als auch die zelltodunabhängigen Funktionen von Caspasen zu verstehen, einschließlich ihrer Gerüstrollen und Funktionen in anderen entzündlichen Signalwegen⁷⁴. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht einen einheitlichen Ansatz bei der Untersuchung von PCD-Signalwegen des angeborenen Immunsystems und der Entzündungssignalisierung über Krankheiten und Zustände hinweg, und dieses Protokoll kann verwendet werden, um kritische regulatorische Prozesse und mechanistische Verbindungen zu identifizieren, die die Entwicklung zukünftiger therapeutischer Strategien beeinflussen werden.