تقييم تنشيط الكاسباز لتقييم موت الخلايا المناعية الفطرية

يعمل جهاز المناعة الفطري كخط دفاع أول أثناء العدوى واستجابة للمثيرات العقيمة، مثل إصابة الأنسجة والتغيرات في الاتزان الداخلي. تستجيب المستشعرات المناعية الفطرية على سطح الخلية وفي السيتوبلازم للأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض أو الضرر (PAMPs أو DAMPs ، على التوالي) لتحفيز مسارات الإشارات الالتهابية والاستجابات الخلوية. تتمثل إحدى العمليات الرئيسية للاستجابة المناعية الفطرية في تحريض موت الخلايا لإزالة الخلايا المصابة أو التالفة وتحفيز المزيد من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية. موت الخلايا المبرمج (PCD) هو عملية محفوظة للغاية عبر الأنواع ، مما يسلط الضوء على أهميتها التطورية كآلية مناعية فطرية.

هناك العديد من مسارات PCD المناعية الفطرية التي يمكن تنشيطها في جميع أنواع الخلايا. Caspases هي عائلة رئيسية من البروتياز المحفوظة للغاية ، داخل الخلايا ، والتي تعتبر حاسمة عبر العديد من مسارات PCD ، بما في ذلك مسار موت الخلايا المبرمج غير الالتهابي تقليديا ، بالإضافة إلى مسارات PCD الالتهابية مثل pyroptosis و necroptosis و PANoptosis¹،²،³،^4،5 . هناك 11 كاسباس بشري و 10 فأر محددة جيدا ، بالإضافة إلى كاسباس زائف قد يكون وظيفيا ، ويتم التعبير عن معظمها بشكل أساسي على أنها أحادي غير نشط أو ثنائي الكاسباز المؤيد للكاسباس الذي يتطلب انقساما للتنشيط ^6,7. تحتوي Caspases أيضا على مجالات مهمة لتجنيد وتشكيل مجمعات متعددة البروتينات. وتشمل هذه المجالات مجال التنشيط والتوظيف caspase (CARD) ، والذي يمكن العثور عليه في caspase-1 و caspase-2 و caspase-4 و caspase-5 و caspase-9 و caspase-11 ، أو مجال مستجيب الموت (DED) ، الموجود في caspase-8 و caspase-10. من خلال كل من نشاطها المحلل للبروتين وقدرتها على تكوين مجمعات متعددة البروتينات ، تعد الكاسباز محركات حاسمة ل PCD المناعي الفطري.

تم تحديد دور caspases في PCD المناعي الفطري لأول مرة في موت الخلايا المبرمج ، حيث يقوم caspases البادئ ، caspase-2 ، caspase-8 ، caspase-9 ، و caspase-10 ، بتنشيط caspases الجلاد ، caspase-3 ، caspase-6 ، و caspase-7 ، لدفع موت الخلايا⁸،⁹،^10،11،12. يمكن تنشيط كاسباس البادئ بواسطة شلالات إشارات متنوعة ؛ ينشط المسار الخارجي Caspase-8 من خلال إشارات مستقبلات الموت التي يسببها الرباط خارج الخلية ، وينشط المسار الداخلي Caspase-9 من خلال تعطيل سلامة الميتوكوندريا¹³. تقوم كاسباس البادئ المنشط بشق الرابط الذي يفصل بين الوحدات الفرعية التحفيزية الكبيرة والصغيرة لكاسباس الجلاد لإنتاج أشكالها النشطة. ثم يقوم الجلاد بشق ركائزه لتفكيك الخلية ، مما يؤدي إلى تدهور الحمض النووي ، وتفجير الغشاء ، والتجزئة النووية ، وإطلاق أجسام موت الخلايا المبرمج^14,15. تنتهي هذه العملية عادة بشكل غير لاتيني وغير التهابي من موت الخلايا عندما تقترن بالإزالة الفورية للخلايا الميتة عن طريق كثرة الخلايا الفعالة¹⁶. ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي العيوب في كثرة الخلايا أو نقص الخلايا البلعمية إلى تراكم الخلايا المبرمج ، والتي تخضع بعد ذلك لموت الخلايا الانحلالية والالتهابية^17,18.

تم اكتشاف أن الكاسباس الالتهابي ، بما في ذلك caspase-1 (الإنسان والفأر) ، caspase-4 و caspase-5 (الإنسان) ، و caspase-11 (الفأر) ، يتم تنشيطه خلال شكل من أشكال التهاب المناعة الفطرية PCD (III-PCD) يسمى pyroptosis. يرتبط تنشيط Caspase-1 بتكوين الالتهابات ، وهي مجمعات متعددة البروتينات تحتوي على مستشعر مناعي فطري خلوي ، وجزيء محول (بروتين شبيه بالبقع مرتبط بموت الخلايا المبرمج يحتوي على CARD [ASC]) ، و caspase-1. يسمح تكوين هذا المركب للكاسباز -1 بالخضوع للتحلل الذاتي بوساطة القرب لإطلاق شكله النشط ، والذي يمكن أن يشق الركائز المستهدفة بما في ذلك السيتوكينات المؤيدة للالتهابات إنترلوكين (IL) -1β و IL-18 وجزيء Gasdermin D المكون للمسام (GSDMD) ¹⁹،20،^21،22،23 . يمكن ل Caspase-11 و caspase-4 و caspase-5 أيضا تنشيط GSDMD دون تكوين المنبع للالتهابات بعد استشعار PAMPs مثل عديد السكاريد الدهني (LPS) ^19,20. تخضع هذه الكاسباز للتثبيط متبوعا بقليل القلة والانقسام الذاتي للتنشيط عند الارتباط ب LPS الخلوي ، مما يؤدي إلى تنشيط التهابي غير قانوني 24،^25،26 وتنشيط caspase-1 بطريقة جوهرية للخلية للحث على نضوج IL-1β و IL-18²⁰. إن نضوج وإطلاق هذه السيتوكينات المؤيدة للالتهابات يميز هذه الكاسباس بأنها “التهابية”. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على كاسباز -8 موت الخلايا المبرمج لتوطين إلى الالتهاب ، مما يوفر صلة بين عمليات موت الخلايا المبرمج والبيروبتوبوتيك. وقد وجدت الدراسات أن موت الخلايا المبرمج caspase-8 أمر بالغ الأهمية أيضا لتنظيم شكل آخر من أشكال PCD يسمى necroptosis. يؤدي فقدان caspase-8 إلى تنشيط السودوكيناز المختلط الشبيه بمجال كيناز السلالة المختلطة (MLKL) بوساطة مستقبلات سيرين ثريونين 3 (RIPK3) لقيادة مسار III-PCD للنخر²⁷،²⁸،²⁹،30،31،³²،^33،34،35.

في حين تم تصنيف الكاسباس تاريخيا على أنه “غير أبوبتويتي” أو “التهابي” بناء على نوع موت الخلايا الذي يبدأه ، تشير الأدلة المتزايدة إلى وجود تداخل مكثف بين مسارات PCD المناعية الفطرية من خلال caspases ^3,4. على سبيل المثال ، يشق caspase-1 الالتهابي من الالتهابات caspase-7 المبرمج في موقع التنشيط الكنسي³⁴. يمكن أن يؤدي تنشيط Caspase-1 أيضا إلى انقسام ركائز موت الخلايا المبرمج مثل بوليميراز بوليميراز 1 (ADP-ribose) 1 (PARP1) ³⁶. في الخلايا التي تفتقر إلى GSDMD ، يمكن أن يشق caspase-1 أيضا caspase-3^37,38. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل caspase-3 المبرمج قانونا أن يشق gasdermin E (GSDME) للحث على PCD^17,18 ويعالج أيضا GSDMD في شكل غير نشط⁴⁰. علاوة على ذلك ، لوحظ تجنيد caspase-8 في المجمع الالتهابي 39،40،41،42،⁴³،⁴⁴،^{45 ،} و caspase-8 هو منظم رئيسي للتنشيط الالتهابي الكنسي وغير الكنسي ³⁹. هناك أيضا أدوار متداخلة وزائدة عن الحاجة ل caspase-8 و caspase-1 في العديد من الحالات الالتهابية ، ويحدث PCD المناعي الفطري الذي يتميز بتنشيط المكونات النارية واللافتوتيكية والميتة عبر طيف المرض³⁹،46،⁴⁷،⁴⁸،^49،50.

بناء على هذا الحديث المتبادل بين الكاسباس الالتهابي وموت الخلايا المبرمج ، تم تحديد فجوة رئيسية في الفهم الميكانيكي للمناعة الفطرية و PCD ، مما أدى إلى اكتشاف PANoptosis. PANoptosis هو شكل فريد من أشكال III-PCD يتم تنشيطه استجابة لمسببات الأمراض ، PAMPs ، DAMPs ، والتغيرات في التوازن ويتم تنظيمه بواسطة PANoptosomes – مجمعات جزيئية متعددة الأوجه تدمج مكونات من مسارات موت الخلايا الأخرى 44،⁵⁰،51،52،53،^54،55 . لا يمكن حساب مجمل التأثيرات البيولوجية في PANoptosis بشكل فردي عن طريق pyroptosis أو موت الخلايا المبرمج أو necroptosis وحده 3،⁴،^35،36،³⁹،⁴⁶،⁴⁷،⁴⁸ ، حيث يتميز PANoptosis بتنشيط caspases متعددة ، بما في ذلك caspase-1 و caspase-11 و caspase-8 و caspase-9 و caspase-3 و / أو caspase-7 ^، اعتمادا على السياق 44،48،49،50،51،52،53،⁵⁴،56،⁵⁷،⁵⁸،⁵⁹،⁶⁰،^61،62 . لقد تورط PANoptosis بشكل متزايد في الأمراض المعدية والالتهابية ، وكذلك في السرطانات وعلاجات السرطان³،⁴،³⁵،^36،39،^44،46،⁴⁷،⁴⁸،⁴⁹،50،51،^52،53 ,^54,56
,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.

نظرا للدور الأساسي للكاسباز عبر مسارات موت الخلايا ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، وداء البروبتوسيس ، والتنخر ، و PANoptosis ، من المهم تطوير تقنيات لتوصيف تنشيطها وفهم التعقيد الكامل لمسارات PCD. يوضح البروتوكول هنا طريقة لتحفيز الخلايا وقياس التنشيط اللاحق للكاسباز (الشكل 1). تستفيد هذه الطريقة من الانقسام المحلل للبروتين للكاسباس ، وهو أمر مطلوب بشكل عام لتنشيطها ، كوسيلة لدراستها. من خلال النشاف الغربي ، يمكن تحديد أحجام البروتين ، مما يسمح بالتصور الواضح والتمايز بين pro-caspases غير النشطة وأشكالها المشقوقة المنشطة.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول في 1) قدرته على تقييم تنشيط كاسباس متعددة بالتوازي من مجموعة واحدة من الخلايا الداخلية لتحديد تنشيط PCD بشكل أكثر دقة و 2) استخدام تقنيات معملية بسيطة نسبيا لا تتطلب تدريبا مكثفا أو معدات باهظة الثمن. استخدمت البروتوكولات السابقة النشاف الغربي ، أو مراسلي الفلورسنت ، أو تلطيخ الأجسام المضادة لمراقبة تنشيط الكاسباز في طافات الثقافة ، والخلايا والأنسجة المحللة ، والخلايا الكاملة عن طريق الفحص المجهري ، وفي الجسم الحي⁶⁷،⁶⁸،⁶⁹،⁷⁰،^{71 ،} ولكن هذه التقنيات بشكل عام تراقب فقط واحد أو اثنين من caspases في العينة. علاوة على ذلك ، في حين تم استخدام ركائز الببتيد الاصطناعية التي تحتوي على مواقع انشقاق الكاسباز التي تتألق عند الانقسام لمراقبة تنشيط الكاسباز في الخلية أو الأنسجة المحللة⁶⁹ ، يمكن في كثير من الأحيان شق هذه الركائز بأكثر من كاسباز واحد ، مما يجعل من الصعب تحديد التنشيط المحدد للكاسباز الفردي في هذا النظام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام النشاف الغربي بدلا من استخدام مراسلي الفلورسنت أو الطرق الأخرى القائمة على العلامات يسمح للباحثين باستخدام الخلايا الداخلية بدلا من إنشاء خطوط خلايا محددة مع جينات المراسل. هناك مزايا متعددة لاستخدام الخلايا الداخلية ، بما في ذلك حقيقة أن العديد من خطوط الخلايا الخالدة تعاني من نقص في جزيئات موت الخلايا الرئيسية^72,73 ، مما قد يؤثر على النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح استخدام الخلايا الداخلية بتقييم أنواع الخلايا المتنوعة ، مثل الضامة والخلايا الظهارية والخلايا البطانية ، بدلا من سلالة واحدة. النشاف الغربي هو أيضا تقنية بسيطة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة يمكن تنفيذها في المختبرات في جميع أنحاء العالم دون الحاجة إلى معدات كبيرة ومكلفة أو إعدادات معقدة.

هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع عبر علم الأحياء لفهم كل من وظائف الكاسباس المعتمدة على موت الخلايا والمستقلة عن موت الخلايا ، بما في ذلك أدوارها ووظائفها في السقالات في مسارات الإشارات الالتهابية الأخرى⁷⁴. يسمح تطبيق هذه الطريقة باتباع نهج موحد في دراسة مسارات PCD المناعية الفطرية والإشارات الالتهابية عبر الأمراض والظروف ، ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد العمليات التنظيمية الحرجة والروابط الميكانيكية التي ستفيد في تطوير الاستراتيجيات العلاجية المستقبلية.