Transfecção eficiente de mRNA transcrito in vitro em células cultivadas usando nanopartículas de peptídeo-poloxamina

A vacinação tem sido anunciada como uma das intervenções médicas mais eficientes para a redução da morbidade e mortalidade causadas por doenças infecciosas¹. A importância das vacinas vem sendo demonstrada desde o surto da doença coronavírus 2019 (COVID-19). Ao contrário do conceito tradicional de injetar patógenos inativados ou atenuados vivos, abordagens de vacinas de última geração, como vacinas à base de ácido nucleico, concentram-se na preservação das propriedades imuno-estimulantes dos patógenos alvo, evitando os potenciais problemas de segurança associados ao vírus microbiano convencional ou em vacinas baseadas em bactérias. Tanto o DNA quanto o RNA (ou seja, vacinas in vitro transcritas do mensageiro, IVT mRNA) exibem profilático ao potencial terapêutico contra uma variedade de doenças, incluindo doenças infecciosas e cânceres ^2,3. Em princípio, o potencial das vacinas à base de ácido nucleico diz respeito à sua produção, eficácia e segurança⁴. Essas vacinas podem ser fabricadas de forma livre de células para permitir uma produção econômica, escalável e rápida.

Uma única vacina à base de ácido nucleico pode codificar vários antígenos, permitindo o alvo de inúmeras variantes virais ou bactérias com um número reduzido de inoculações e fortalecendo a resposta imune contra patógenos resistentes ^5,6. Além disso, vacinas à base de ácido nucleico poderiam imitar o processo natural de invasão de vírus ou infecção bacteriana, trazendo respostas imunes mediadas por células B e T. Ao contrário de algumas vacinas baseadas em DNA, as vacinas baseadas em IC mRNA oferecem uma enorme vantagem em termos de segurança. Eles podem expressar rapidamente o antígeno desejado no citosol e não estão integrados ao genoma hospedeiro, evitando preocupações sobre mutagênese insercional⁷. O IVT-mRNA é automaticamente degradado após a tradução bem sucedida, de modo que sua cinética de expressão proteica pode ser facilmente controlada ^8,9. Catalisados pela síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2), os esforços de empresas/instituições em todo o mundo permitiram a liberação para o mercado de muitos tipos de vacinas. A tecnologia de vacinas baseada em IG mRNA mostra grande potencial e, pela primeira vez, demonstrou seu sucesso anteriormente antecipado, devido ao seu rápido design e capacidade flexível de se adaptar a qualquer antígeno-alvo dentro de vários meses. O sucesso das vacinas IVT mRNA contra o COVID-19 em aplicações clínicas não só abriu uma nova era de pesquisa e desenvolvimento de vacinas IVT mRNA como também acumulou experiência valiosa para o rápido desenvolvimento de vacinas eficazes para lidar com surtos de doenças infecciosas^10,11.

Apesar do potencial promissor das vacinas IVT mRNA, a eficiente entrega intracelular de IVT mRNA para o local de ação (ou seja, citoplasma) continua a representar um grande obstáculo¹², especialmente para aqueles administrados via vias aéreas⁴. IVT mRNA é inerentemente uma molécula instável com uma meia-vida extremamente curta (~7 h)¹³, o que torna o IVT mRNA altamente propenso à degradação pelo onipresente RNase¹⁴. Os linfócitos do sistema imunológico inato tendem a engolir o reconhecido IVT mRNA em casos de aplicação in vivo . Além disso, a alta densidade de carga negativa e o grande peso molecular (1 x 10^4-1 x 10⁶ Da) de IVT mRNA prejudicam sua efetiva permeação através da bicamada lipídica aniônica das membranas celulares¹⁵. Portanto, um sistema de entrega com certos materiais biofuncionais é necessário para inibir a degradação das moléculas de mRNA IVT e facilitar a absorção celular¹⁶.

Além de alguns casos excepcionais em que o MRNA IVT nu foi diretamente utilizado para investigações in vivo, vários sistemas de entrega são usados para transportar IVT mRNA para o local terapêutico da ação^17,18. Estudos anteriores revelaram que apenas alguns mRNAs IVT são detectados em citosol sem a assistência de um sistema de entrega¹⁹. Inúmeras estratégias foram desenvolvidas para melhorar a entrega de RNA com esforços contínuos no campo, desde condensação de protamina até encapsulamento lipídicos²⁰. As nanopartículas lipídicas (LNPs) são as mais clinicamente avançadas entre os veículos de entrega de mRNA, como comprovado pelo fato de que todas as vacinas aprovadas de mRNA COVID-19 para uso clínico empregam sistemas de entrega baseados em LNP²¹. No entanto, os LNPs não podem mediar a transfecção eficaz do mRNA quando as formulações são entregues através da rota respiratória²², o que limita notavelmente a aplicação dessas formulações na indução de respostas imunes mucosas ou no enfrentamento de doenças relacionadas com o pulmão, como fibrose cística ou deficiência de α1-antitripsina. Portanto, é necessário desenvolver um novo sistema de entrega para facilitar a entrega eficiente e transfecção de IVT mRNA em células relacionadas às vias aéreas para resolver essa necessidade não atendida.

Foi confirmado que o sistema de entrega de nanopartículas auto-montadas de peptídeo-poloxamina (PP-sNp) pode mediar a transfecção eficiente de ácidos nucleicos no trato respiratório dos camundongos²³. O PP-sNp adota uma abordagem de design modular multifuncional, que pode integrar diferentes módulos funcionais nas nanopartículas para triagem rápida e otimização²³. Os peptídeos sintéticos e copolímeros de blocos anfílicos eletricamente neutros (poloxamina) dentro do PP-sNp podem interagir espontaneamente com o IVT mRNA para gerar nanopartículas distribuídas uniformemente com uma estrutura compacta e superfície lisa²³. PP-sNp pode melhorar o efeito de transfecção genética de moléculas de IVT mRNA em células cultivadas e o trato respiratório de camundongos²³. O presente estudo descreve um protocolo para geração de PP-sNp contendo iGM que codifica a Luciferase Metridia (MetLuc-mRNA) (Figura 1). A mistura controlada e rápida através de um dispositivo de mistura microfluida, que emprega o design de mistura de herringbone escalonado, é utilizada neste protocolo. O procedimento é fácil de executar e permite a geração de PP-sNp com tamanhos mais uniformes. O objetivo geral da produção pp-sNp usando o misturador microfluido é criar PP-sNp para a complexação de mRNA de forma bem controlada, permitindo assim transfecção celular eficiente e reprodutível in vitro. O presente protocolo descreve a preparação, montagem e caracterização do PP-sNp contendo MetLuc-mRNA.