Effiziente Transfektion von in vitro transkribierter mRNA in kultivierten Zellen mit Peptid-Poloxamin-Nanopartikeln

Die Impfung gilt als eine der effizientesten medizinischen Maßnahmen zur Verringerung der Morbidität und Mortalität durch Infektionskrankheiten¹. Die Bedeutung von Impfstoffen zeigt sich seit dem Ausbruch der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19). Im Gegensatz zum traditionellen Konzept der Injektion inaktivierter oder lebend attenuierter Krankheitserreger konzentrieren sich moderne Impfstoffansätze, wie z. B. Impfstoffe auf Nukleinsäurebasis, darauf, die immunstimulierenden Eigenschaften der Zielpathogene zu erhalten und gleichzeitig die potenziellen Sicherheitsprobleme zu vermeiden, die mit den herkömmlichen ganzmikrobiellen Virus- oder bakterienbasierten Impfstoffen verbunden sind. Sowohl DNA- als auch RNA-Impfstoffe (d. h. in vitro transkribierte Boten-RNA, IVT mRNA) weisen ein prophylaktisches bis therapeutisches Potenzial gegen eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Infektionskrankheiten und^{Krebs, auf 2,3}. Grundsätzlich bezieht sich das Potenzial von Impfstoffen auf Nukleinsäurebasis auf ihre Herstellung, Wirksamkeit und Sicherheit⁴. Diese Impfstoffe können zellfrei hergestellt werden, um eine kostengünstige, skalierbare und schnelle Produktion zu ermöglichen.

Ein einziger Impfstoff auf Nukleinsäurebasis kann mehrere Antigene kodieren, was das Ziel zahlreicher viraler Varianten oder Bakterien mit einer reduzierten Anzahl von Impfungen ermöglicht und die Immunantwort gegen resistente Krankheitserreger stärkt ^5,6. Außerdem könnten Impfstoffe auf Nukleinsäurebasis den natürlichen Invasionsprozess von Virus- oder Bakterieninfektionen nachahmen und sowohl B-Zell- als auch T-Zell-vermittelte Immunantworten hervorrufen. Im Gegensatz zu einigen virus- oder DNA-basierten Impfstoffen bieten IVT-mRNA-basierte Impfstoffe einen großen Sicherheitsvorteil. Sie können das gewünschte Antigen schnell im Zytosol exprimieren und sind nicht in das Wirtsgenom integriert, was Bedenken hinsichtlich der Insertionsmutagenese beseitigt⁷. IVT-mRNA wird nach erfolgreicher Translation automatisch abgebaut, so dass ihre Proteinexpressionskinetik leicht kontrolliert werden kann ^8,9. Katalysiert durch die Pandemie des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) haben die Bemühungen von Unternehmen / Institutionen weltweit die Markteinführung vieler Arten von Impfstoffen ermöglicht. Die IVT-mRNA-basierte Impfstofftechnologie zeigt großes Potenzial und hat zum ersten Mal ihren zuvor erwarteten Erfolg gezeigt, da sie schnell entwickelt und flexibel in der Lage ist, sich innerhalb weniger Monate an beliebige Zielantigene anzupassen. Der Erfolg von IVT-mRNA-Impfstoffen gegen COVID-19 in klinischen Anwendungen eröffnete nicht nur eine neue Ära der Forschung und Entwicklung von IVT-mRNA-Impfstoffen, sondern sammelte auch wertvolle Erfahrungen für die schnelle Entwicklung wirksamer Impfstoffe zur Behandlung von Ausbrüchen von Infektionskrankheiten^10,11.

Trotz des vielversprechenden Potenzials von IVT-mRNA-Impfstoffen stellt die effiziente intrazelluläre Abgabe von IVT-mRNA an den Wirkort (d. h. Zytoplasma) weiterhin eine große Hürde^{dar 12}, insbesondere für diejenigen, die über die Atemwege verabreicht^{werden 4}. IVT mRNA ist von Natur aus ein instabiles Molekül mit einer extrem kurzen Halbwertszeit (~7 h)¹³, was IVT mRNA sehr anfällig für den Abbau durch die ubiquitäre RNase¹⁴ macht. Die Lymphozyten des angeborenen Immunsystems neigen dazu, die anerkannte IVT-mRNA in Fällen der in vivo-Anwendung zu verschlingen. Darüber hinaus beeinträchtigen die hohe negative Ladungsdichte und das große Molekulargewicht (1 x 10^4-1 x 10⁶ Da) der IVT-mRNA ihre effektive Permeation über die anionische Lipiddoppelschicht von Zellmembranen¹⁵. Daher ist ein Abgabesystem mit bestimmten biofunktionellen Materialien erforderlich, um den Abbau der IVT-mRNA-Moleküle zu hemmen und die zelluläre Aufnahme zu erleichtern¹⁶.

Abgesehen von einigen Ausnahmefällen, in denen nackte IVT-mRNA direkt für in vivo Untersuchungen verwendet wurde, werden verschiedene Abgabesysteme verwendet, um IVT-mRNA zum therapeutischen Wirkort^{zu transportieren 17,18}. Frühere Studien haben gezeigt, dass nur wenige IVT-mRNAs im Zytosol ohne die Hilfe eines Abgabesystems nachgewiesen werden¹⁹. Zahlreiche Strategien wurden entwickelt, um die RNA-Lieferung mit kontinuierlichen Bemühungen auf diesem Gebiet zu verbessern, die von der Protaminkondensation bis zur Lipidverkapselung reichen²⁰. Lipid-Nanopartikel (LNPs) sind die klinisch am weitesten fortgeschrittenen mRNA-Verabreichungsvehikel, wie die Tatsache beweist, dass alle zugelassenen mRNA-COVID-19-Impfstoffe für den klinischen Gebrauch LNP-basierte Verabreichungssysteme verwenden²¹. LNPs können jedoch keine effektive mRNA-Transfektion vermitteln, wenn die Formulierungen über den respiratorischen Weg²² verabreicht werden, was die Anwendung dieser Formulierungen bei der Induktion von Schleimhautimmunantworten oder bei der Behandlung pulmonalbedingter Erkrankungen wie Mukoviszidose oder α1-Antitrypsin-Mangel bemerkenswert einschränkt. Daher ist die Entwicklung eines neuartigen Abgabesystems erforderlich, um die effiziente Abgabe und Transfektion von IVT-mRNA in atemwegsbezogenen Zellen zu erleichtern, um diesen ungedeckten Bedarf zu decken.

Es wurde bestätigt, dass das Peptid-Poloxamin-selbstorganisierende Nanopartikel-Abgabesystem (PP-sNp) die effiziente Transfektion von Nukleinsäuren in den Atemwegen von Mäusen vermitteln kann²³. Das PP-sNp verfolgt einen multifunktionalen modularen Designansatz, der verschiedene Funktionsmodule in die Nanopartikel für ein schnelles Screening und Optimierung integrieren kann²³. Die synthetischen Peptide und elektrisch neutralen amphiphilen Blockcopolymere (Poloxamin) innerhalb des PP-sNp können spontan mit IVT-mRNA interagieren, um gleichmäßig verteilte Nanopartikel mit kompakter Struktur und glatter Oberfläche zu erzeugen²³. PP-sNp kann den Gentransfektionseffekt von IVT-mRNA-Molekülen in kultivierten Zellen und den Atemwegen von Mäusen verbessern²³. Die vorliegende Studie beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von PP-sNp mit IVT-mRNA, das Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) kodiert (Abbildung 1). In diesem Protokoll wird eine kontrollierte und schnelle Durchmischung über eine mikrofluidische Mischvorrichtung verwendet, die das versetzte Fischgrätenmischdesign verwendet. Das Verfahren ist einfach durchzuführen und ermöglicht die Erzeugung von PP-sNp mit einheitlicheren Größen. Das allgemeine Ziel der PP-sNp-Produktion mit dem mikrofluidischen Mischer ist es, PP-sNp für die mRNA-Komplexierung auf gut kontrollierte Weise zu erzeugen und so eine effiziente und reproduzierbare Zelltransfektion in vitro zu ermöglichen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung, Montage und Charakterisierung von PP-sNp enthaltender MetLuc-mRNA.