Transfection efficace d’ARNm transcrit in vitro dans des cellules cultivées à l’aide de nanoparticules de peptide-poloxamine

La vaccination a été annoncée comme l’une des interventions médicales les plus efficaces pour réduire la morbidité et la mortalité causées par les maladies infectieuses¹. L’importance des vaccins a été démontrée depuis l’épidémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Contrairement au concept traditionnel d’injection d’agents pathogènes inactivés ou vivants atténués, les approches vaccinales de pointe, telles que les vaccins à base d’acides nucléiques, se concentrent sur la préservation des propriétés immunostimulantes des agents pathogènes cibles tout en évitant les problèmes d’innocuité potentiels associés aux vaccins conventionnels à base de virus microbiens entiers ou à bactéries. Les vaccins à base d’ADN et d’ARN (c.-à-d. ARN messager transcrit in vitro, ARNm IVT) présentent un potentiel prophylactique à thérapeutique contre diverses maladies, y compris les maladies infectieuses et les cancers ^2,3. En principe, le potentiel des vaccins à base d’acides nucléiques est lié à leur production, à leur efficacité et à leur innocuité⁴. Ces vaccins peuvent être fabriqués sans cellules pour permettre une production rentable, évolutive et rapide.

Un seul vaccin à base d’acide nucléique peut coder pour plusieurs antigènes, ce qui permet de cibler de nombreuses variantes virales ou bactéries avec un nombre réduit d’inoculations et de renforcer la réponse immunitaire contre les agents pathogènes résilients ^5,6. En outre, les vaccins à base d’acides nucléiques pourraient imiter le processus d’invasion naturel d’une infection virale ou bactérienne, apportant à la fois des réponses immunitaires médiées par les cellules B et T. Contrairement à certains vaccins à base de virus ou d’ADN, les vaccins à base d’ARNm IVT offrent un énorme avantage en termes de sécurité. Ils peuvent rapidement exprimer l’antigène désiré dans le cytosol et ne sont pas intégrés dans le génome de l’hôte, ce qui évite les inquiétudes concernant la mutagénèse insertionnelle⁷. L’ARNm IVT est automatiquement dégradé après une traduction réussie, de sorte que sa cinétique d’expression protéique peut être facilement contrôlée ^8,9. Catalysés par la pandémie de coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), les efforts des entreprises / institutions du monde entier ont permis la mise sur le marché de nombreux types de vaccins. La technologie vaccinale à base d’ARNm IVT présente un grand potentiel et, pour la première fois, a démontré son succès précédemment attendu, en raison de sa conception rapide et de sa capacité flexible à s’adapter à n’importe quel antigène cible en quelques mois. Le succès des vaccins à ARNm IVT contre la COVID-19 dans les applications cliniques a non seulement ouvert une nouvelle ère de recherche et de développement de vaccins à ARNm IVT, mais a également accumulé une expérience précieuse pour le développement rapide de vaccins efficaces pour faire face aux épidémies de maladies infectieuses^10,11.

Malgré le potentiel prometteur des vaccins à ARNm IVT, l’administration intracellulaire efficace de l’ARNm IVT au site d’action (cytoplasme) continue de poser un obstacle majeur¹², en particulier pour ceux administrés par les voies respiratoires⁴. L’ARNm IVT est intrinsèquement une molécule instable avec une demi-vie extrêmement courte (~7 h)¹³, ce qui rend l’ARNm IVT très sujet à la dégradation par l’omniprésente RNase¹⁴. Les lymphocytes du système immunitaire inné ont tendance à engloutir l’ARNm IVT reconnu en cas d’application in vivo . De plus, la densité de charge négative élevée et le poids moléculaire élevé (1 x 10^4-1 x 10⁶ Da) de l’ARNm IVT altèrent sa perméation efficace à travers la bicouche lipidique anionique des membranes cellulaires¹⁵. Par conséquent, un système d’administration avec certains matériaux biofonctionnels est nécessaire pour inhiber la dégradation des molécules d’ARNm IVT et faciliter l’absorption cellulaire¹⁶.

Mis à part quelques cas exceptionnels dans lesquels l’ARNm IVT nu a été directement utilisé pour des investigations in vivo, divers systèmes d’administration sont utilisés pour transporter l’ARNm IVT vers le site d’action thérapeutique^17,18. Des études antérieures ont révélé que seuls quelques ARNm IVT sont détectés dans le cytosol sans l’aide d’un système d’administration¹⁹. De nombreuses stratégies ont été développées pour améliorer la livraison de l’ARN avec des efforts continus sur le terrain, allant de la condensation de protamine à l’encapsulation^{lipidique 20}. Les nanoparticules lipidiques (LNP) sont les plus avancées cliniquement parmi les véhicules d’administration d’ARNm, comme le prouve le fait que tous les vaccins à ARNm COVID-19 approuvés pour un usage clinique utilisent des systèmes d’administration basés sur la LNP²¹. Cependant, les LNP ne peuvent pas arbitrer une transfection efficace de l’ARNm lorsque les formulations sont administrées par voie respiratoire²², ce qui limite remarquablement l’application de ces formulations pour induire des réponses immunitaires muqueuses ou traiter des maladies pulmonaires telles que la mucoviscidose ou le déficit en α1-antitrypsine. Par conséquent, le développement d’un nouveau système d’administration pour faciliter la livraison et la transfection efficaces de l’ARNm IVT dans les cellules liées aux voies respiratoires est nécessaire pour répondre à ce besoin non satisfait.

Il a été confirmé que le système d’administration de nanoparticules auto-assemblées peptide-poloxamine (PP-sNp) peut arbitrer la transfection efficace des acides nucléiques dans les voies respiratoires des souris²³. Le PP-sNp adopte une approche de conception modulaire multifonctionnelle, qui peut intégrer différents modules fonctionnels dans les nanoparticules pour un criblage et une optimisation rapides²³. Les peptides synthétiques et les copolymères blocs amphiphiles électriquement neutres (poloxamine) au sein du PP-sNp peuvent interagir spontanément avec l’ARNm IVT pour générer des nanoparticules uniformément distribuées avec une structure compacte et une surface lisse²³. PP-sNp peut améliorer l’effet de transfection génique des molécules d’ARNm IVT dans les cellules en culture et les voies respiratoires de souris²³. La présente étude décrit un protocole de génération d’ARNm PP-sNp contenant de l’IVT codant pour la Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (Figure 1). Un mélange contrôlé et rapide via un dispositif de mélange microfluidique, qui utilise la conception de mélange à chevrons décalés, est utilisé dans ce protocole. La procédure est facile à exécuter et permet la génération de PP-sNp avec des tailles plus uniformes. L’objectif général de la production de PP-sNp à l’aide du mélangeur microfluidique est de créer du PP-sNp pour la complexation de l’ARNm de manière bien contrôlée, permettant ainsi une transfection cellulaire efficace et reproductible in vitro. Le présent protocole décrit la préparation, l’assemblage et la caractérisation du PP-sNp contenant de l’ARNm MetLuc.