Isolamento e quantificazione del virus Epstein-Barr dalla linea cellulare P3HR1
Summary
Questo protocollo consente l’isolamento delle particelle virali di Epstein-Barr dalla linea cellulare umana P3HR1 inducendo il ciclo litico virale con forbolo 12-miristato 13-acetato. Il DNA viene successivamente estratto dalla preparazione virale e sottoposto a PCR in tempo reale per quantificare la concentrazione di particelle virali.
Abstract
Il virus di Epstein-Barr (EBV), formalmente designato come herpesvirus umano 4 (HHV-4), è il primo virus tumorale umano isolato. Quasi il 90-95% della popolazione adulta mondiale è infettata da EBV. Con i recenti progressi nella biologia molecolare e nell’immunologia, l’applicazione di modelli sperimentali sia in vitro che in vivo ha fornito informazioni approfondite e significative sulla patogenesi dell’EBV in molte malattie e sulla tumorigenesi associata all’EBV. Lo scopo di questo esperimento visualizzato è quello di fornire una panoramica dell’isolamento delle particelle virali EBV dalle cellule della linea cellulare P3HR1, seguita dalla quantificazione della preparazione virale. Le cellule P3HR1, originariamente isolate da un linfoma di Burkitt umano, possono produrre un virus P3HR1, che è un ceppo EBV di tipo 2. Il ciclo litico EBV può essere indotto in queste cellule P3HR1 mediante trattamento con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA), producendo particelle virali EBV.
Utilizzando questo protocollo per l’isolamento delle particelle EBV, le cellule P3HR1 vengono coltivate per 5 giorni a 37 °C e al 5% di CO2 in mezzo RPMI-1640 completo contenente 35 ng/mL PMA. Successivamente, il terreno di coltura viene centrifugato ad una velocità di 120 x g per 8 minuti per pellettare le cellule. Il surnatante contenente virus viene quindi raccolto e fatto girare ad una velocità di 16.000 x g per 90 minuti per pellettare le particelle EBV. Il pellet virale viene quindi risospeso in un mezzo RPMI-1640 completo. Questo è seguito dall’estrazione del DNA e dalla PCR quantitativa in tempo reale per valutare la concentrazione di particelle EBV nel preparato.
Introduction
Il virus di Epstein-Barr (EBV) è il primo virus tumorale umano ad essere stato isolato1. EBV, formalmente indicato come Human herpesvirus 4 (HHV-4) 2, fa parte della sottofamiglia gamma herpes virus della famiglia dei virus dell’herpes ed è il prototipo del genere Lymphocryptovirus . Quasi il 90-95% della popolazione adulta mondiale è infettata dal virus3. Nella maggior parte dei casi, l’infezione iniziale si verifica entro i primi 3 anni di vita ed è asintomatica, tuttavia, se l’infezione si verifica più tardi durante l’adolescenza, può dare origine a una malattia denominata mononucleosi infettiva4. L’EBV è in grado di infettare le cellule B a riposo inducendole a diventare linfoblasti B proliferativi in cui il virus stabilisce e mantiene uno stato latente di infezione5. L’EBV può riattivarsi in qualsiasi momento e quindi portare a infezioni ricorrenti6.
Negli ultimi 50 anni, l’associazione tra alcuni virus e lo sviluppo di tumori maligni umani è diventata sempre più evidente e oggi si stima che dal 15% al 20% di tutti i tumori umani siano correlati a infezioni virali7. I virus dell’herpes, tra cui EBV, sono alcuni degli esempi meglio studiati di questi tipi di virus tumorali8. Infatti, l’EBV può causare molti tipi di tumori maligni umani, come il linfoma di Burkitt (BL), il linfoma di Hodgkin (HL), il linfoma diffuso a grandi cellule B e le malattie linfoproliferative negli ospiti immunocompromessi 9,10. L’EBV ha anche dimostrato di essere associato allo sviluppo di malattie autoimmuni sistemiche. Alcuni esempi di questi disturbi autoimmuni sono l’artrite reumatoide (RA), la polimiosite-dermatomiosite (PM-DM), il lupus eritematoso sistemico (LES), la malattia mista del tessuto connettivo (MCTD) e la sindrome di Sjögren (SS)11. L’EBV è anche associato allo sviluppo della malattia infiammatoria intestinale (IBD)12.
Molte di queste malattie possono essere studiate o modellate utilizzando colture cellulari, topi o altri organismi infetti da EBV. Ecco perché le particelle EBV sono necessarie per infettare cellule o organismi, sia in vitro che in vivo modelli13,14,15,16, da qui la necessità di sviluppare una tecnica che consenta l’isolamento delle particelle virali a basso costo. Il protocollo qui descritto fornisce linee guida per un modo semplice per isolare in modo affidabile le particelle EBV da una linea cellulare relativamente accessibile e per quantificare le particelle utilizzando la PCR in tempo reale, che è economica e prontamente disponibile per la maggior parte dei laboratori. Questo è in confronto a molti altri metodi che sono stati descritti per isolare EBV da diverse linee cellulari17,18,19,20.
P3HR-1 è una linea cellulare BL che cresce in sospensione ed è latente infettata da un ceppo EBV di tipo 2. Questa linea cellulare è un produttore di EBV e può essere indotta a produrre particelle virali. L’obiettivo di questo manoscritto è quello di mostrare un metodo che consente l’isolamento delle particelle EBV dalla linea cellulare P3HR-1, seguito dalla quantificazione dello stock virale che potrebbe essere successivamente utilizzato per modelli sperimentali EBV sia in vitro che in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La produzione di particelle EBV è necessaria per comprendere la biologia di questo virus e le sue malattie associate. Qui abbiamo descritto la produzione di queste particelle dalla linea cellulare P3HR-1. Questa linea cellulare non è l’unica linea produttrice di EBV; infatti, particelle EBV sono state isolate anche dalle cellule B95-821,22 e dalla linea cellulare Raji18,19. Il ciclo litico EBV è stato…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a ER dal Fondo di ricerca Asmar, dal Consiglio nazionale libanese per la ricerca scientifica (L-CNRS) e dal Piano di pratica medica (MPP) presso l’Università americana di Beirut.
Materials
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
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