Isolierung und Quantifizierung des Epstein-Barr-Virus aus der P3HR1-Zelllinie
Summary
Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung von Epstein-Barr-Viruspartikeln aus der menschlichen P3HR1-Zelllinie nach Induktion des viralen lytischen Zyklus mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat. Anschließend wird DNA aus der viralen Zubereitung extrahiert und einer Real-Time-PCR unterzogen, um die Viruspartikelkonzentration zu quantifizieren.
Abstract
Das Epstein-Barr-Virus (EBV), offiziell als Humanes Herpesvirus 4 (HHV-4) bezeichnet, ist das erste isolierte humane Tumorvirus. Fast 90-95% der erwachsenen Weltbevölkerung sind mit EBV infiziert. Mit den jüngsten Fortschritten in der Molekularbiologie und Immunologie hat die Anwendung von experimentellen In-vitro – und In-vivo-Modellen tiefe und aussagekräftige Einblicke in die Pathogenese von EBV bei vielen Krankheiten sowie in die EBV-assoziierte Tumorgenese ermöglicht. Ziel dieser visualisierten Experimentierarbeit ist es, einen Überblick über die Isolierung von EBV-Viruspartikeln aus Zellen der P3HR1-Zelllinie zu geben, gefolgt von einer Quantifizierung der viralen Zubereitung. P3HR1-Zellen, die ursprünglich aus einem menschlichen Burkitt-Lymphom isoliert wurden, können ein P3HR1-Virus produzieren, das ein EBV-Stamm vom Typ 2 ist. Der EBV-lytische Zyklus kann in diesen P3HR1-Zellen durch Behandlung mit Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) induziert werden, wodurch EBV-Viruspartikel entstehen.
Unter Verwendung dieses Protokolls zur Isolierung von EBV-Partikeln werden P3HR1-Zellen für 5 Tage bei 37 °C und 5%CO2 in vollständigem RPMI-1640-Medium kultiviert, das 35 ng/ml PMA enthält. Anschließend wird das Kulturmedium mit einer Geschwindigkeit von 120 x g für 8 min zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der virushaltige Überstand wird dann gesammelt und mit einer Geschwindigkeit von 16.000 x g für 90 min heruntergeschleudert, um die EBV-Partikel zu pelletieren. Das virale Pellet wird dann in einem vollständigen RPMI-1640-Medium resuspendiert. Es folgen DNA-Extraktion und quantitative real-time PCR, um die Konzentration von EBV-Partikeln in der Zubereitung zu bestimmen.
Introduction
Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist das erste humane Tumorvirus, das isoliert wurde1. EBV, offiziell als Humanes Herpesvirus 4 (HHV-4)2 bezeichnet, ist Teil der Gamma-Herpesvirus-Unterfamilie der Herpesvirusfamilie und ist der Prototyp der Lymphocryptovirus-Gattung. Fast 90-95% der erwachsenen Weltbevölkerung sind mit dem Virus infiziert3. In den meisten Fällen tritt die Erstinfektion innerhalb der ersten 3 Lebensjahre auf und ist asymptomatisch, wenn die Infektion jedoch später während der Adoleszenz auftritt, kann dies zu einer Krankheit führen, die als infektiöse Mononukleosebezeichnet wird 4. EBV ist in der Lage, ruhende B-Zellen zu infizieren, wodurch sie zu proliferativen B-Lymphoblasten werden, in denen das Virus einen latent infizierten Zustand aufbaut und aufrechterhält5. EBV kann jederzeit reaktiviert werden und so zu wiederkehrenden Infektionen führen6.
In den letzten 50 Jahren ist der Zusammenhang zwischen einigen Viren und der Entwicklung menschlicher Malignome immer deutlicher geworden, und heute wird geschätzt, dass 15% bis 20% aller menschlichen Krebserkrankungen mit Virusinfektionen zusammenhängen7. Die Herpesviren, einschließlich EBV, sind einige der am besten untersuchten Beispiele für diese Art von Tumorviren8. Tatsächlich kann EBV viele Arten von menschlichen Malignomen verursachen, wie Burkitt-Lymphom (BL), Hodgkin-Lymphom (HL), diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom und lymphoproliferative Erkrankungen in immungeschwächten Wirten 9,10. Es wurde auch gezeigt, dass EBV mit der Entwicklung systemischer Autoimmunerkrankungen assoziiert ist. Einige Beispiele für diese Autoimmunerkrankungen sind rheumatoide Arthritis (RA), Polymyositis-Dermatomyositis (PM-DM), systemischer Lupus erythematodes (SLE), gemischte Bindegewebserkrankung (MCTD) und Sjögren-Syndrom (SS)11. EBV ist auch mit der Entwicklung von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) verbunden12.
Viele dieser Krankheiten können mit Zellkulturen, Mäusen oder anderen Organismen, die mit EBV infiziert sind, untersucht oder modelliert werden. Aus diesem Grund werden EBV-Partikel benötigt, um Zellen oder Organismen zu infizieren, sei es in vitro oder in vivo Modellen13,14,15,16, daher die Notwendigkeit, eine Technik zu entwickeln, die die Isolierung von Viruspartikeln zu niedrigen Kosten ermöglicht. Das hier beschriebene Protokoll bietet Richtlinien für eine einfache Möglichkeit, EBV-Partikel zuverlässig aus einer relativ zugänglichen Zelllinie zu isolieren und die Partikel mittels real-time PCR zu quantifizieren, die kostengünstig und für die meisten Labore leicht verfügbar ist. Dies steht im Vergleich zu mehreren anderen Methoden, die beschrieben wurden, um EBV aus verschiedenen Zelllinien zu isolieren17,18,19,20.
P3HR-1 ist eine BL-Zelllinie, die in Suspension wächst und latent mit einem EBV-Typ-2-Stamm infiziert ist. Diese Zelllinie ist ein EBV-Produzent und kann dazu gebracht werden, virale Partikel zu produzieren. Das Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zu demonstrieren, die die Isolierung von EBV-Partikeln aus der P3HR-1-Zelllinie ermöglicht, gefolgt von einer Quantifizierung des Virusbestands, die später sowohl für in vitro als auch in vivo EBV-Versuchsmodelle verwendet werden könnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Produktion von EBV-Partikeln ist notwendig, um die Biologie dieses Virus sowie die damit verbundenen Krankheiten zu verstehen. Hier haben wir die Herstellung dieser Partikel aus der P3HR-1-Zelllinie beschrieben. Diese Zelllinie ist nicht die einzige EBV-Produktionslinie; Tatsächlich wurden EBV-Partikel auch aus B95-8-Zellen21,22 sowie der Raji-Zelllinie18,19 isoliert. Der EBV-lytische Zyklus wurde in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung dieser Arbeit wurde durch Zuschüsse des Asmar Research Fund, des Lebanese National Council for Scientific Research (L-CNRS) und des Medical Practice Plan (MPP) an der American University of Beirut unterstützt.
Materials
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
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