Ce protocole permet d’isoler les particules du virus d’Epstein-Barr de la lignée cellulaire humaine P3HR1 lors de l’induction du cycle lytique viral avec le phorbol 12-myristate 13-acétate. L’ADN est ensuite extrait de la préparation virale et soumis à une PCR en temps réel pour quantifier la concentration de particules virales.
Le virus d’Epstein-Barr (EBV), officiellement désigné comme herpèsvirus humain 4 (HHV-4), est le premier virus tumoral humain isolé. Près de 90 à 95% de la population adulte mondiale est infectée par le VEB. Avec les progrès récents de la biologie moléculaire et de l’immunologie, l’application de modèles expérimentaux in vitro et in vivo a fourni un aperçu approfondi et significatif de la pathogenèse du VEB dans de nombreuses maladies ainsi que de la tumorigenèse associée au VEB. L’objectif de cet article d’expérience visualisé est de fournir une vue d’ensemble de l’isolement des particules virales EBV à partir de cellules de la lignée cellulaire P3HR1, suivi d’une quantification de la préparation virale. Les cellules P3HR1, isolées à l’origine d’un lymphome de Burkitt humain, peuvent produire un virus P3HR1, qui est une souche de type 2 du VEB. Le cycle lytique EBV peut être induit dans ces cellules P3HR1 par traitement avec phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), produisant des particules virales EBV.
En utilisant ce protocole pour l’isolement des particules EBV, les cellules P3HR1 sont cultivées pendant 5 jours à 37 °C et 5% de CO2 dans un milieu RPMI-1640 complet contenant 35 ng / mL de PMA. Par la suite, le milieu de culture est centrifugé à une vitesse de 120 x g pendant 8 min pour granuler les cellules. Le surnageant contenant le virus est ensuite recueilli et filé à une vitesse de 16 000 x g pendant 90 minutes pour granuler les particules EBV. La pastille virale est ensuite remise en suspension dans un milieu RPMI-1640 complet. Ceci est suivi par l’extraction de l’ADN et la PCR quantitative en temps réel pour évaluer la concentration de particules EBV dans la préparation.
Le virus d’Epstein-Barr (EBV) est le premier virus tumoral humain à avoir été isolé1. Le VEB, officiellement appelé herpèsvirus humain 4 (HHV-4)2, fait partie de la sous-famille des virus de l’herpès gamma de la famille des virus de l’herpès et est le prototype du genre Lymphocryptovirus. Près de 90 à 95% de la population adulte mondiale est infectée par le virus3. Dans la plupart des cas, l’infection initiale survient au cours des 3 premières années de vie et est asymptomatique, cependant, si l’infection survient plus tard au cours de l’adolescence, elle peut donner lieu à une maladie appelée mononucléose infectieuse4. Le VEB est capable d’infecter les lymphocytes B au repos, les incitant à devenir des lymphoblastes B prolifératifs dans lesquels le virus établit et maintient un état d’infection latente5. Le VEB peut se réactiver à tout moment et ainsi entraîner des infections récurrentes6.
Au cours des 50 dernières années, l’association entre certains virus et le développement de tumeurs malignes humaines est devenue de plus en plus évidente, et on estime aujourd’hui que 15% à 20% de tous les cancers humains sont liés à des infections virales7. Les virus de l’herpès, y compris EBV, sont parmi les exemples les mieux étudiés de ces types de virus tumoraux8. En fait, le VEB peut causer de nombreux types de tumeurs malignes humaines, comme le lymphome de Burkitt (LB), le lymphome hodgkinien (LH), le lymphome diffus à grandes cellules B et les maladies lymphoprolifératives chez les hôtes immunodéprimés 9,10. Il a également été démontré que le VEB est associé au développement de maladies auto-immunes systémiques. Quelques exemples de ces maladies auto-immunes sont la polyarthrite rhumatoïde (PR), la polymyosite-dermatomyosite (PM-DM), le lupus érythémateux disséminé (LED), la maladie mixte du tissu conjonctif (MCTD) et le syndrome de Gougerot-Sjögren (SS)11. Le VEB est également associé au développement d’une maladie inflammatoire de l’intestin (MII)12.
Bon nombre de ces maladies peuvent être étudiées ou modélisées à l’aide de cultures cellulaires, de souris ou d’autres organismes infectés par le VEB. C’est pourquoi les particules EBV sont nécessaires pour infecter des cellules ou des organismes, que ce soit in vitro ou in vivo modèles13,14,15,16, d’où la nécessité de développer une technique permettant d’isoler les particules virales à faible coût. Le protocole décrit ici fournit des lignes directrices pour un moyen facile d’isoler de manière fiable les particules EBV d’une lignée cellulaire relativement accessible et de quantifier les particules en utilisant la PCR en temps réel, qui est rentable et facilement disponible pour la plupart des laboratoires. Ceci est en comparaison avec plusieurs autres méthodes qui ont été décrites pour isoler le VEB de différentes lignées cellulaires17,18,19,20.
P3HR-1 est une lignée cellulaire BL qui se développe en suspension et est infectée de manière latente par une souche EBV de type 2. Cette lignée cellulaire est productrice d’EBV et peut être induite à produire des particules virales. L’objectif de ce manuscrit est de présenter une méthode qui permet d’isoler les particules d’EBV de la lignée cellulaire P3HR-1, suivie d’une quantification du stock viral qui pourrait ensuite être utilisée pour des modèles expérimentaux de VEB in vitro et in vivo .
La production de particules EBV est nécessaire pour comprendre la biologie de ce virus ainsi que ses maladies associées. Ici, nous avons décrit la production de ces particules à partir de la lignée cellulaire P3HR-1. Cette lignée cellulaire n’est pas la seule lignée productrice d’EBV; en fait, des particules d’EBV ont également été isolées à partir de cellules B95-821,22 ainsi que de la lignée cellulaire Raji18,19<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Le financement de ce travail a été soutenu par des subventions à ER du Fonds de recherche Asmar, du Conseil national libanais pour la recherche scientifique (L-CNRS) et du Medical Practice Plan (MPP) de l’Université américaine de Beyrouth.
0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
DMSO | Amresco | 0231 | |
DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
Phenol | VWR | 20599.297 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |