Isolamento e quantificação do vírus Epstein-Barr a partir da linhagem celular P3HR1
Summary
Este protocolo permite o isolamento de partículas do vírus Epstein-Barr da linhagem celular humana P3HR1 ao induzir o ciclo lítico viral com 12-miristato de forbol 13-acetato. O DNA é subsequentemente extraído da preparação viral e submetido a PCR em tempo real para quantificar a concentração de partículas virais.
Abstract
O vírus Epstein-Barr (EBV), formalmente designado como herpesvírus humano 4 (HHV-4), é o primeiro vírus tumoral humano isolado. Quase 90-95% da população adulta do mundo está infectada pelo EBV. Com os recentes avanços em biologia molecular e imunologia, a aplicação de modelos experimentais in vitro e in vivo forneceu uma visão profunda e significativa da patogênese do EBV em muitas doenças, bem como da tumorigênese associada ao EBV. O objetivo deste trabalho experimental visualizado é fornecer uma visão geral do isolamento de partículas virais de EBV de células da linhagem celular P3HR1, seguido de quantificação da preparação viral. As células P3HR1, originalmente isoladas de um linfoma de Burkitt humano, podem produzir um vírus P3HR1, que é uma cepa de EBV tipo 2. O ciclo lítico do EBV pode ser induzido nessas células P3HR1 pelo tratamento com 12-miristato de forbol 13-acetato (PMA), produzindo partículas virais de EBV.
Usando este protocolo para o isolamento de partículas de EBV, as células P3HR1 são cultivadas por 5 dias a 37 °C e 5% de CO2 em meio completo RPMI-1640 contendo 35 ng/mL de PMA. Posteriormente, o meio de cultura é centrifugado a uma velocidade de 120 x g por 8 min para peletizar as células. O sobrenadante contendo vírus é então coletado e girado a uma velocidade de 16.000 x g por 90 min para pellet as partículas de EBV. O pellet viral é então ressuspenso em um meio RPMI-1640 completo. Isto é seguido por extração de DNA e PCR quantitativa em tempo real para avaliar a concentração de partículas de EBV na preparação.
Introduction
O vírus Epstein-Barr (EBV) é o primeiro vírus tumoral humano a ser isolado1. O EBV, formalmente referido como herpesvírus humano 4 (HHV-4)2, faz parte da subfamília do vírus do herpes gama da família do vírus do herpes e é o protótipo do gênero Lymphocryptovirus . Quase 90-95% da população adulta do mundo está infectada pelo vírus3. Na maioria dos casos, a infecção inicial ocorre nos primeiros 3 anos de vida e é assintomática, no entanto, se a infecção ocorrer mais tarde durante a adolescência, pode dar origem a uma doença referida como mononucleose infecciosa4. O EBV é capaz de infectar células B em repouso, induzindo-as a se tornarem linfoblastos B proliferativos nos quais o vírus estabelece e mantém um estado de infecção latente5. O EBV pode ser reativado a qualquer momento e, assim, levar a infecções recorrentes6.
Nos últimos 50 anos, a associação entre alguns vírus e o desenvolvimento de malignidades humanas tornou-se cada vez mais evidente, e hoje estima-se que 15% a 20% de todos os cânceres humanos estejam relacionados a infecções virais7. Os vírus do herpes, incluindo o EBV, são alguns dos exemplos mais bem estudados desses tipos de vírus tumorais8. De fato, o EBV pode causar muitos tipos de neoplasias malignas humanas, como linfoma de Burkitt (BL), linfoma de Hodgkin (LH), linfoma difuso de grandes células B e doenças linfoproliferativas em hospedeiros imunocomprometidos 9,10. O EBV também demonstrou estar associado ao desenvolvimento de doenças autoimunes sistêmicas. Alguns exemplos dessas doenças autoimunes são artrite reumatoide (AR), polimiosite-dermatomiosite (PM-DM), lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença mista do tecido conjuntivo (MCTD) e síndrome de Sjögren (SS)11. O EBV também está associado ao desenvolvimento de doença inflamatória intestinal (DII)12.
Muitas dessas doenças podem ser estudadas ou modeladas usando cultura de células, camundongos ou outros organismos infectados com EBV. É por isso que as partículas de EBV são necessárias para infectar células ou organismos, seja em modelos in vitro ou in vivo 13,14,15,16, daí a necessidade de desenvolver uma técnica que permita o isolamento de partículas virais a um baixo custo. O protocolo descrito aqui fornece diretrizes para uma maneira fácil de isolar de forma confiável as partículas de EBV de uma linhagem celular relativamente acessível e quantificar as partículas usando PCR em tempo real, que é econômica e prontamente disponível para a maioria dos laboratórios. Isso ocorre em comparação com vários outros métodos que têm sido descritos para isolar o EBV de diferentes linhagens celulares17,18,19,20.
P3HR-1 é uma linhagem celular BL que cresce em suspensão e é infectada de forma latente com uma cepa de EBV tipo 2. Esta linhagem celular é produtora de EBV e pode ser induzida a produzir partículas virais. O objetivo deste manuscrito é apresentar um método que permita o isolamento de partículas de EBV da linhagem celular P3HR-1, seguido da quantificação do estoque viral que poderia ser posteriormente utilizado para modelos experimentais de EBV in vitro e in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
A produção de partículas de EBV é necessária para a compreensão da biologia deste vírus, bem como suas doenças associadas. Aqui descrevemos a produção dessas partículas a partir da linhagem celular P3HR-1. Esta linhagem celular não é a única linha produtora de EBV; de fato, as partículas de EBV também foram isoladas das células B95-821,22, bem como da linhagem celular Raji18,19. O ciclo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento para este trabalho foi apoiado por doações ao ER do Asmar Research Fund, do Conselho Nacional Libanês de Pesquisa Científica (L-CNRS) e do Plano de Prática Médica (MPP) da Universidade Americana de Beirute.
Materials
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100×20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
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