نقدم بروتوكولا مفصلا لزراعة أجنة الفئران والتصوير الذي يتيح تصوير وقت 3D + للخلايا السلفية القلبية. تتناول مجموعة أدوات الفيديو هذه المهارات الأساسية المطلوبة للتصوير المباشر الناجح الذي يصعب اكتسابه من المنشورات النصية فقط.
تتضمن الخطوات الأولى لنمو القلب تغييرات جذرية في سلوك الخلية والتمايز. بينما يسمح تحليل الأجنة الثابتة بدراسة مراحل نمو محددة بالتفصيل في لقطة ثابتة ، فإن التصوير الحي يلتقط الأحداث المورفولوجية الديناميكية ، مثل هجرة الخلايا وتغيرات الشكل والتمايز ، عن طريق تصوير الجنين أثناء تطوره. هذا يكمل التحليل الثابت ويوسع فهم كيفية تطور الأعضاء أثناء التطور الجنيني. على الرغم من مزاياه ، نادرا ما يستخدم التصوير المباشر في نماذج الماوس بسبب تحدياته التقنية. تكون أجنة الفئران المبكرة حساسة عند استزراعها خارج الجسم الحي وتتطلب معالجة فعالة. لتسهيل الاستخدام الأوسع للتصوير الحي في أبحاث نمو الفئران ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للفحص المجهري الحي ثنائي الفوتون الذي يسمح باكتساب أجنة الفئران على المدى الطويل. بالإضافة إلى البروتوكول ، يتم تقديم نصائح حول التعامل مع الأجنة وتحسين الثقافة. سيساعد هذا في فهم الأحداث الرئيسية في تكوين أعضاء الفئران المبكرة ، مما يعزز فهم بيولوجيا السلف القلبي الوعائي.
يتشكل القلب مبكرا أثناء التطور الجنيني لبدء ضخ العناصر الغذائية إلى الجنين بأكمله ، بينما يستمر في النمو1. في أجنة الفئران ، بعد يوم ونصف من بدء المعدة ، يتجمع عضو القلب البدائي في القطب الأمامي 2,3. بحلول مرحلة الخط المبكر (ES) ، يدخل السلف القلبي في epiblast عبر الخط البدائي إلى طبقة الأديم المتوسط الوليدة4،5،6 ويبدأ في الهجرة إلى القطب الأمامي ، حيث يتمايز لتشكيل أنبوب القلب البدائي. خلال هذه العملية ، يخضع أسلاف القلب الأوائل لإعادة ترتيب الخلايا ، وتحولات الشكل ، والتمايز ، بالإضافة إلى الهجرة7 (الشكل 1).
اجتذب أسلاف القلب الأوائل الباحثين لما يقرب من قرن من الزمان بسبب قدرتهم الرائعة على التمييز وبناء عضو وظيفي في وقت واحد. على مدى العقدين الماضيين ، أظهر التحليل النسيلي ونماذج الضربة القاضية الشرطية أن نمو القلب المبكر ينطوي على مصادر خلايا متميزة في عملية ديناميكية للغاية8،9،10. ومع ذلك ، فإن البنية ثلاثية الأبعاد لأنبوب القلب البدائي والطبيعة الديناميكية لتشكله تجعل من الصعب دراسته (الشكل 1) ، ونحن بعيدون عن فهم تعقيده الكامل11.
لدراسة هذه العمليات الخلوية الديناميكية ، تقدم طرق التصوير الحية الآن تفاصيل غير مسبوقة7،12،13،14. في نموذج الماوس ، كانت الأساليب الحية أساسية لاستجواب الموضوعات التنموية التي يصعب معالجتها من خلال التحليل الثابت7،13،15. في حين أن زراعة الجسم الحي على المدى الطويل وإعدادات المجهر القوية تتقدم بسرعة16,17 ، فإن القليل من الباحثين لديهم الخبرة اللازمة لتصوير الأجنة الحية بنجاح. على الرغم من أن المنشورات الورقية توفر تفاصيل فنية كافية لإعادة إنتاج تجارب التصوير الحية ، إلا أنه من الصعب فهم بعض المهارات والحيل بدون أمثلة مرئية أو مساعدة من نظير إلى نظير. لتسريع عملية التعلم هذه ونشر استخدام التصوير الحي بين المختبرات ، قمنا بتجميع بروتوكول فيديو (الشكل 2) يجمع المهارات اللازمة لإجراء التصوير الحي على أجنة الفئران المعدة.
الشكل 1: التمايز المبكر للخلايا السلفية القلبية في جنين الفأر من بداية عملية شد المعدة إلى المرحلة التي تسبق تكوين أنبوب القلب البدائي. تدخل الخلايا السلفية القلبية الأديم المتوسط بعد وقت قصير من بدء المعدة ، وتهاجر إلى الجانب الآخر من الجنين. تتم كتابة مرحلة اليوم المورفولوجي والجنيني (E) أعلى المخططات. تصور الأسهم المتقطعة مسار هجرة أسلاف أنبوب القلب البدائي أثناء المعدة. تم تكييف هذا الرقم من11. الاختصارات: ES = الخط المبكر ؛ MS = الخط الأوسط ؛ EHF = طية الرأس المبكرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط سير العمل للتصوير الحي لأسلاف القلب المبكرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
ينتظم أسلاف القلب الأوائل في أنبوب قلب بدائي يبدأ في النبض بينما لا يزال يتشكل. يعد فهم كيفية حدوث هذه العملية أمرا أساسيا لتحديد مجموعة واسعة من عيوب القلب الخلقية لأحداث مورفوجينية محددة. لذلك ، يوفر التصوير الحي فرصة لدراسة التطور الجنيني الطبيعي والمعيب مع زيادة الدقة الزمنية. هذا مفي…
The authors have nothing to disclose.
يعترف المؤلفون بالدكتور كينزو إيفانوفيتش لعمله السابق على هذه الطريقة ومجموعة الدكتور شيجينوري نوناكا (المعاهد الوطنية للعلوم الطبيعية ، اليابان) لتوفير الخبرة الأولية في تركيب الأجنة. تم دعم هذه الدراسة من قبل Grant PGC2018-096486-B-I00 من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية و Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 من برنامج EU Horizon 2020 إلى MT و Grant 1380918 من برنامج التشغيل FEDER Andalucía 2014-2020 إلى JND. تم دعم MS من خلال زمالة الدكتوراه في مؤسسة La Caixa (LCF / BQ / DE18 / 11670014) وزمالة سفر شركة علماء الأحياء (DEVTF181145). يتم دعم CNIC من قبل وزارة العلوم الإسبانية ومؤسسة ProCNIC.
#55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
Distilled water | |||
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
P1000 and P200 pipettes | |||
Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
Pipette tips | |||
Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
Tungsten needles | |||
Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |