Imagem ao vivo de progenitores cardíacos precoces no embrião de camundongo
Summary
Apresentamos um protocolo detalhado para cultura e imagem de embriões de camundongos que permite imagens 3D + tempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de ferramentas de vídeo aborda as principais habilidades necessárias para o sucesso da geração de imagens ao vivo, de outra forma difíceis de adquirir de publicações somente de texto.
Abstract
Os primeiros passos do desenvolvimento cardíaco implicam mudanças drásticas no comportamento e diferenciação celular. Enquanto a análise de embriões fixos permite estudar em detalhes estágios específicos de desenvolvimento em um instantâneo estático, a imagem ao vivo captura eventos morfogenéticos dinâmicos, como migração celular, mudanças de forma e diferenciação, por meio de imagens do embrião à medida que ele se desenvolve. Isso complementa a análise fixa e expande a compreensão de como os órgãos se desenvolvem durante a embriogênese. Apesar de suas vantagens, a imagem ao vivo raramente é usada em modelos de mouse por causa de seus desafios técnicos. Os embriões precoces de camundongos são sensíveis quando cultivados ex vivo e requerem manuseio eficiente. Para facilitar um uso mais amplo de imagens vivas em pesquisas de desenvolvimento de camundongos, este artigo apresenta um protocolo detalhado para microscopia viva de dois fótons que permite a aquisição a longo prazo em embriões de camundongos. Além do protocolo, são fornecidas dicas sobre manuseio de embriões e otimização da cultura. Isso ajudará a entender os principais eventos na organogênese precoce do camundongo, melhorando a compreensão da biologia do progenitor cardiovascular.
Introduction
O coração se forma cedo durante a embriogênese para começar a bombear nutrientes para todo o embrião, enquanto ele continua se desenvolvendo1. Em embriões de camundongos, um dia e meio após o início da gastrulação, um órgão cardíaco rudimentar se reúne no polo anterior 2,3. No estágio Early Streak (ES), os progenitores cardíacos no epiblasto ingressam através da estria primitiva para a camada mesodérmica nascente 4,5,6 e começam a migrar para o polo anterior, onde se diferenciam para formar o tubo cardíaco primitivo. Ao longo desse processo, os progenitores cardíacos precoces passam por rearranjos celulares, transformações de forma e diferenciação, além da migração7 (Figura 1).
Os primeiros progenitores cardíacos atraíram pesquisadores por quase um século devido à sua notável capacidade de diferenciar e construir um órgão funcional simultaneamente. Nas últimas duas décadas, a análise clonal e os modelos de knockout condicional mostraram que o desenvolvimento cardíaco precoce implica fontes celulares distintas em um processo altamente dinâmico 8,9,10. No entanto, a estrutura 3D do tubo cardíaco primitivo e a natureza dinâmica de sua morfogênese o tornam difícil de estudar (Figura 1), e estamos longe de compreender toda a sua complexidade11.
Para estudar esses processos celulares dinâmicos, os métodos de imagem ao vivo agora oferecem um detalhe sem precedentes 7,12,13,14. No modelo de camundongos, as abordagens ao vivo têm sido fundamentais para interrogar tópicos de desenvolvimento que são difíceis de abordar pela análise estática 7,13,15. Embora a cultura ex vivo de longo prazo e as configurações robustas de microscópio estejam avançando rapidamente16,17, poucos pesquisadores têm a experiência para obter imagens bem-sucedidas de embriões vivos. Embora as publicações baseadas em papel forneçam detalhes técnicos suficientes para reproduzir experimentos de imagem ao vivo, algumas habilidades e truques são difíceis de entender sem exemplos visuais ou assistência peer-to-peer. Para acelerar esse processo de aprendizagem e difundir o uso de imagens ao vivo entre os laboratórios, montamos um protocolo de vídeo (Figura 2) que reúne as habilidades necessárias para realizar imagens ao vivo em embriões de camundongos gastrulantes.
Figura 1: Diferenciação precoce das células progenitoras cardíacas no embrião de camundongo desde o início da gastrulação até o estágio que precede a formação primitiva do tubo cardíaco. As células progenitoras cardíacas entram no mesoderma logo após o início da gastrulação, migrando para o lado oposto do embrião. O estágio morfológico e embrionário do dia (E) é escrito em cima dos diagramas. As setas tracejadas retratam a trajetória de migração de progenitores primitivos do tubo cardíaco durante a gastrulação. Este número foi adaptado de11. Abreviaturas: ES = Early Streak; MS = Estria Média; EHF = Early Head Fold. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diagrama de fluxo de trabalho para imagens ao vivo dos primeiros progenitores cardíacos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os primeiros progenitores cardíacos se organizam em um tubo cardíaco primitivo que começa a bater enquanto ainda está se formando. Entender como esse processo ocorre é fundamental para identificar o amplo espectro de defeitos cardíacos congênitos para eventos morfogenéticos específicos. Para isso, a imagem ao vivo oferece uma oportunidade de estudar o desenvolvimento embrionário normal e defeituoso com maior resolução temporal. Isso é especialmente útil para estudar as células progenitoras cardíacas preco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o Dr. Kenzo Ivanovitch pelo trabalho anterior sobre este método e o grupo do Dr. Shigenori Nonaka (Institutos Nacionais de Ciências Naturais, Japão) por fornecer a experiência inicial na montagem de embriões. Este estudo foi apoiado pelo Grant PGC2018-096486-B-I00 do Ministério da Ciência e Inovação espanhol e Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 do programa EU Horizon 2020 para MT e Grant 1380918 do FEDER Andalucía 2014-2020 Programa Operacional para JND. O MS foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Fundação La Caixa (LCF/BQ/DE18/11670014) e pela bolsa itinerante da The Company of Biologists (DEVTF181145). O CNIC é apoiado pelo Ministério da Ciência espanhol e pela Fundação ProCNIC.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
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