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Developmental Biology

ダイズ共生団塊からのポリソーム精製

Published: July 01, 2022
doi:
10.3791/64269
, , , , , ,
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía,Universidad de la República, 2Departamento de Genómica,Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology,University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias,Universidad de la República

Summary

このプロトコルは、無傷のダイズ結節からの真核生物ポリソーム精製のための方法を記載する。シーケンシング後、遺伝子発現解析の標準パイプラインを使用して、トランスクリプトームおよびトランスラトームレベルで発現差のある遺伝子を同定できます。

Abstract

このプロトコルの目的は、ダイズ(Glycine max)共生結節の真核生物トランスラトームを研究するための戦略を提供することです。この論文では、RNAシーケンシングを使用して分析される植物由来のポリリボソームとそれに関連するmRNAを分離するために最適化された方法について説明します。まず、細胞質ライセートは、凍結大豆団塊全体からポリソームおよびRNA保存条件でホモジナイズすることによって得られます。次に、ライセートを低速遠心分離で除去し、上清の15%をトータルRNA(TOTAL)単離に使用します。残りの透明ライセートは、2層のスクロースクッション(12%および33.5%)を介した超遠心分離によってポリソームを単離するために使用されます。ポリソーム関連mRNA(PAR)は、再懸濁後にポリソームペレットから精製されます。TOTALとPARはどちらも、RNA-seqのシーケンシングライブラリの品質基準を満たすために、高感度キャピラリー電気泳動によって評価されます。ダウンストリームアプリケーションの例として、シーケンシング後、遺伝子発現解析のための標準パイプラインを使用して、トランスクリプトームおよびトランスラトームレベルで発現差のある遺伝子を取得できます。要約すると、この方法は、RNA-seqと組み合わせて、共生結節などの複雑な組織における真核生物mRNAの翻訳制御の研究を可能にします。

Introduction

ダイズ(グリシンマックス)などのマメ科植物は、根粒菌と呼ばれる特定の土壌細菌との共生を確立することができます。この相利共生的な関係は、植物の根に新しい器官、共生結節の形成を誘発します。結節は細菌を宿主とする植物器官であり、その細胞質がバクテロイドと呼ばれる特殊な形態の根粒菌でコロニー形成されている宿主細胞からなる。これらのバクテロイドは、大気中の窒素(N 2)をアンモニアに還元することを触媒し、アンモニアは炭水化物1,2と引き換えに植物に移される。

この窒素固定共生は、最もよく研究されている植物と微生物の共生の1つですが、さまざまな非生物的ストレス条件にさらされた植物が共生パートナーとの相互作用をどのように調節するか、これが結節代謝にどのように影響するかなど、多くの側面がよりよく理解されていません。これらのプロセスは、結節トランスラトーム(すなわち、メッセンジャーRNAのサブセット[mRNA]が活発に翻訳される)を分析することによってよりよく理解できる可能性があります。ポリリボソームまたはポリソームは、mRNAに関連する複数のリボソームの複合体であり、翻訳の研究に一般的に使用されます3。ポリソームプロファイリング法は、ポリソームに関連するmRNAの解析で構成されており、多様な生物学的プロセスで発生する遺伝子発現を制御する転写後メカニズムの研究に成功しています4,5。

歴史的に、ゲノム発現解析は主にmRNA存在量の決定に焦点を当ててきました6,7,8,9。しかし、遺伝子発現の転写後調節、特に翻訳の異なる段階のために、転写産物とタンパク質レベルの間には相関関係がない10、11、12。さらに、トランスクリプトームのレベルでの変化とトランスラトーム13のレベルで起こる変化との間に依存性は観察されていない。翻訳されているmRNAのセットを直接分析することで、mRNAレベルのみを分析した場合よりも、細胞遺伝子発現(エンドポイントはタンパク質存在量)をより正確かつ完全に測定できます14,15,16。

このプロトコルは、植物由来のポリソームが、2層のショ糖クッションを介した差動遠心分離によって無傷の大豆結節からどのように精製されるかを説明しています(図1)。しかしながら、バクテロイド由来のリボソームも結節に存在するので、真核生物のものが主要な画分(90%〜95%)を表すとしても、リボソームとRNA種の混合物が精製される。その後のRNA単離、定量、および品質管理についても説明します(図1)。このプロトコルは、RNA-seqと組み合わせて、共生結節などの複雑な組織における真核生物mRNAの翻訳制御に関する実験結果を提供するはずです。

Figure 1
図1:共生結節からの真核生物ポリソーム精製のための提案された方法論の概略概要。 このスキームは、(1)植物の成長と(2)結節の収穫から(3)細胞質抽出物の調製、(3)TOTALサンプルと(4)PARサンプルの取得、および(5)RNA抽出と品質管理。略語:PEB =ポリソーム抽出バッファー;RB = 再懸濁バッファー;合計=総RNA;PAR = ポリソーム関連mRNA。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

1.植物の成長と根粒菌の接種 必要な結節を生成するには、制御された条件下で成長チャンバー内の選択した基質に選択した大豆種子を播種します。注:このプロトコルでは、種子は砂:バーミキュライト(1:1)の混合物で満たされた0.5Lのペットボトルに播種されました。成長チャンバーは、昼/夜のサイクル温度をそれぞれ28°C/20°C、明暗日長をそれぞれ16時間/8時間に設定し…

Representative Results

RNAシーケンシングなどのほとんどのダウンストリームアプリケーションでは、高品質のサンプルがライブラリ調製とシーケンシングの基本であるため、上記の手順で精製されたTOTALおよびPAR画分の量と品質の評価は、その成功を決定するための鍵となります。さらに、RNA分子の完全性により、試料採取18の瞬間における遺伝子発現プロファイルのスナップショットの捕捉が可…

Discussion

細胞遺伝子発現のエンドポイントはタンパク質の存在量であるため、翻訳レベルでの遺伝子発現調節の研究は、さまざまな生物学的プロセスをよりよく理解するために重要です13,14。これは、ポリソーム画分を精製すべき目的の組織または生物のトランスラトームを分析し、それに関連するmRNAを分析することによって評価できます3</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、CSIC I + D 2020助成金番号282、FVF 2017助成金番号210、およびPEDECIBA (マリアマーササインツ)によって資金提供されました。

Materials

Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker Daihan Scientific Model SHO-1D
YEM-medium Amresco J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3 Merck 221295
Porometer Decagon Device Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23 Sigma-Aldrich P1254
Centrifuge Sigma Model 2K15
Chloranphenicol Sigma-Aldrich C0378
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DOC Sigma-Aldrich 30970
DTT Sigma-Aldrich D9779
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Igepal CA 360 Sigma-Aldrich I8896
KCl Merck 1.04936
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Plastic tissue grinder Fisher Scientific 12649595
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PTE Sigma-Aldrich P2393
Tris Invitrogen 15504-020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Weighing dish  Deltalab 1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose Invitrogen 15503022
SW 40 Ti rotor Beckman-Coulter
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344059 13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose Thermo scientific R0492
Bioanalyzer Agilent Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform DI 41191
Ethanol Dorwil UN1170
Isopropanol Mallinckrodt 3032-06
Glycogen Sigma 10814-010
TRIzol LS Ambion 102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL Biologix 10-0152
Filter tips 10 µL BioPointe Scientific 321-4050
Filter tips 1000 µL BioPointe Scientific 361-1050
Filter tips 20 µL BioPointe Scientific 341-4050
Filter tips 200 µL Tarsons 528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Tarsons 500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL Tarsons 500020-N
Sequencing company Macrogen
Sterile 250 mL flask Marienfeld 4110207
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References

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