Очистка полисом от симбиотических конкреций сои
Summary
Этот протокол описывает метод очистки эукариотических полисом от интактных соевых конкреций. После секвенирования стандартные конвейеры для анализа экспрессии генов могут быть использованы для идентификации дифференциально экспрессированных генов на уровнях транскриптома и трансплантома.
Abstract
Целью данного протокола является обеспечение стратегии изучения эукариотического транслектома симбиотического узелка сои (Глицин макс). В данной работе описываются методы, оптимизированные для выделения полирибосом растительного происхождения и связанных с ними мРНК, для анализа с использованием РНК-секвенирования. Во-первых, цитоплазматы получают путем гомогенизации в полисом- и РНК-сохраняющих условиях из цельных замороженных соевых конкреций. Затем лизаты очищаются низкоскоростным центрифугированием, и 15% супернатанта используется для полной изоляции РНК (TOTAL). Оставшийся очищенный лизат используют для выделения полисом ультрацентрифугированием через двухслойную сахарозную подушку (12% и 33,5%). Полисомно-ассоциированная мРНК (PAR) очищается от полисомальных гранул после повторной суспензии. Как TOTAL, так и PAR оцениваются высокочувствительным капиллярным электрофорезом для соответствия стандартам качества библиотек секвенирования для RNA-seq. В качестве примера последующего применения, после секвенирования стандартные конвейеры для анализа экспрессии генов могут быть использованы для получения дифференциально экспрессированных генов на уровнях транскриптома и транслейлома. Таким образом, этот метод в сочетании с RNA-seq позволяет изучать трансляционную регуляцию эукариотических мРНК в сложной ткани, такой как симбиотический узелок.
Introduction
Бобовые растения, такие как соя (Glycine max), могут устанавливать симбиоз со специфическими почвенными бактериями, называемыми rhizobia. Эти взаимные отношения вызывают образование новых органов, симбиотических узелков, на корнях растений. Узелки являются растительными органами, содержащими бактерии, и состоят из клеток-хозяев, чья цитоплазма колонизирована специализированной формой ризобии, называемой бактероидами. Эти бактероиды катализируют восстановление атмосферного азота (N2) в аммиак, который передается растению в обмен на углеводы 1,2.
Хотя этот азотфиксирующий симбиоз является одним из наиболее хорошо изученных симбиозов растений и микробов, многие аспекты еще предстоит лучше понять, например, как растения, подвергшиеся различным абиотическим стрессовым условиям, модулируют свое взаимодействие со своим симбиотическим партнером и как это влияет на метаболизм конкреций. Эти процессы можно было бы лучше понять, проанализировав конкретный транслейтом (т.е. подмножество мессенджерных РНК [мРНК], активно транслировавшихся). Полирибосомы или полисомы представляют собой комплексы множественных рибосом, связанных с мРНК, обычно используемых для изучения трансляции3. Метод профилирования полисом состоит из анализа мРНК, связанных с полисомами, и успешно используется для изучения посттранскрипционных механизмов, контролирующих экспрессию генов, возникающих в различных биологических процессах 4,5.
Исторически сложилось так, что анализ экспрессии генома был сосредоточен в первую очередь на определении обилия мРНК 6,7,8,9. Тем не менее, существует отсутствие корреляции между уровнями транскрипта и белка из-за различных стадий посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, особенно трансляции 10,11,12. Более того, не наблюдалось никакой зависимости между изменениями на уровне транскриптома и теми, которые происходят на уровне транслейтома13. Прямой анализ набора транслируемых мРНК позволяет более точно и полно измерить экспрессию клеточного гена (конечной точкой которого является обилие белка), чем тот, который получен, когда анализируются только уровни мРНК 14,15,16.
Этот протокол описывает, как полисомы растительного происхождения очищаются от неповрежденных соевых конкреций путем дифференциального центрифугирования через двухслойную сахарозную подушку (рисунок 1). Однако, поскольку рибосомы, полученные из бактероидов, также присутствуют в узелках, смесь рибосом и видов РНК очищается, хотя эукариотические представляют собой основную фракцию (90%-95%). Описаны также последующее выделение РНК, количественная оценка и контроль качества (рисунок 1). Этот протокол в сочетании с RNA-seq должен обеспечить экспериментальные результаты по трансляционной регуляции эукариотических мРНК в сложной ткани, такой как симбиотический узелок.
Рисунок 1: Схематический обзор предлагаемой методики очистки эукариотических полисом от симбиотических конкреций. Схема дает обзор этапов, используемых в протоколе от (1) роста растений и (2) сбора конкреций до (3) приготовления цитозольных экстрактов, (3) получения ОБЩИХ образцов и (4) образцов PAR, а также (5) экстракции РНК и контроля качества. Сокращения: PEB = буфер экстракции полисом; RB = буфер повторного суспендирования; TOTAL = общая РНК; PAR = полисомно-ассоциированная мРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изучение регуляции экспрессии генов на трансляционном уровне имеет решающее значение для лучшего понимания различных биологических процессов, поскольку конечной точкой экспрессии клеточных генов является обилие белка13,14. Это можно оценить, проанализ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось грантом CSIC I+D 2020 No 282, грантом FVF 2017 No 210 и PEDECIBA (Мария Марта Сайнс).
Materials
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
- King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -. L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
- Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
- Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
- Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghaemoglobin synthesis in snake beans. Biochemical Journal. 125 (4), 1075-1080 (1971).
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- . Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33) Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011)
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
- Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
- Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
- Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
- Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer’s disease model mice. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
- Zanetti, M. E., Chang, I. -. F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
- Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).
