Purificação polissóbica de nódulos simbióticos de soja
Summary
Este protocolo descreve um método de purificação de pórsome eucariótico a partir de nódulos de soja intactos. Após o sequenciamento, os dutos padrão para análise de expressão genética podem ser usados para identificar genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e translatome.
Abstract
O objetivo deste protocolo é fornecer uma estratégia para estudar o traduzindo eucariótico do nódulo simbiótico de soja (Glycine max). Este artigo descreve métodos otimizados para isolar poliribos derivados de plantas e seus mRNAs associados a serem analisados usando sequenciamento de RNA. Em primeiro lugar, os licoplasatos citoplasmados são obtidos através da homogeneização em condições de preservação de poliso e RNA de nódulos inteiros e congelados de soja. Em seguida, os lysates são limpos por centrifugação de baixa velocidade, e 15% do supernante é usado para o isolamento total do RNA (TOTAL). O restante do lise limpo é usado para isolar pórsomeos por ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose de duas camadas (12% e 33,5%). O mRNA (PAR) associado ao polissomo é purificado a partir de pelotas polissonais após a ressuspensão. Tanto total quanto PAR são avaliados por eletroforese capilar altamente sensível para atender aos padrões de qualidade das bibliotecas de sequenciamento para RNA-seq. Como exemplo de uma aplicação a jusante, após o sequenciamento, os pipelines padrão para análise de expressão genética podem ser usados para obter genes expressos diferencialmente nos níveis de transcriptome e tradução. Em resumo, este método, em combinação com o RNA-seq, permite o estudo da regulação translacional de mRNAs eucarióticas em um tecido complexo como o nódulo simbiótico.
Introduction
Plantas leguminous, como a soja (Glycine max), podem estabelecer simbiose com bactérias específicas do solo chamadas rizobia. Essa relação mutualista provoca a formação de novos órgãos, os nódulos simbióticos, nas raízes das plantas. Os nódulos são os órgãos vegetais que hospedam as bactérias e consistem em células hospedeiras cujo citoplasma é colonizado com uma forma especializada de rizobia chamada bacteroides. Esses bacteroides catalisam a redução do nitrogênio atmosférico (N2) em amônia, que é transferida para a planta em troca de carboidratos 1,2.
Embora essa simbiose fixador de nitrogênio seja uma das simbioses vegetais mais bem estudadas, muitos aspectos continuam sendo melhor compreendidos, como como as plantas submetidas a diferentes condições de estresse abiótico modulam sua interação com seu parceiro simbiótico e como isso afeta o metabolismo do nódulo. Esses processos poderiam ser melhor compreendidos analisando o translatome de nódulo (ou seja, o subconjunto de RNAs mensageiros [mRNAs] traduzido ativamente). Poliribosomes ou polissomos são complexos de ribossomos múltiplos associados ao mRNA, comumente usado para estudar a tradução3. O método de perfil polisome consiste na análise dos mRNAs associados aos polissomos e tem sido utilizado com sucesso para estudar os mecanismos pós-transcriionais que controlam a expressão genética que ocorre em diversos processos biológicos 4,5.
Historicamente, a análise da expressão do genoma tem focado principalmente na determinação da abundância de mRNA 6,7,8,9. No entanto, há falta de correlação entre a transcrição e os níveis de proteína devido aos diferentes estágios de regulação pós-escrita da expressão genética, particularmente a tradução 10,11,12. Além disso, não foi observada dependência entre as alterações no nível do transcriptome e aquelas que ocorrem no nível do traduzome13. A análise direta do conjunto de mRNAs que estão sendo traduzidos permite uma medição mais precisa e completa da expressão genética celular (cujo ponto final é a abundância de proteínas) do que a obtida quando apenas os níveis de mRNA são analisados 14,15,16.
Este protocolo descreve como os polimentos derivados das plantas são purificados de nódulos de soja intactos por centrifugação diferencial através de uma almofada de sacarose de duas camadas (Figura 1). No entanto, uma vez que os ribossomos derivados de bacteroides também estão presentes nos nódulos, uma mistura de ribossomos e espécies de RNA são purificadas, embora as eucarióticas representem a fração principal (90%-95%). O subsequente isolamento do RNA, quantificação e controle de qualidade também são descritos (Figura 1). Este protocolo, em combinação com o RNA-seq, deve fornecer resultados experimentais sobre a regulação translacional de mRNAs eucarióticas em um tecido complexo como o nódulo simbiótico.
Figura 1: Visão geral esquemática da metodologia proposta para purificação de pórsomee eucariótico a partir de nódulos simbióticos. O esquema fornece uma visão geral das etapas seguidas no protocolo de (1) crescimento vegetal e (2) colheita de nódulos até (3) preparação dos extratos citolíticos, (3) obtenção de amostras TOTAIS e (4) amostras PAR e (5) extração e controle de qualidade do RNA. Abreviaturas: PEB = tampão de extração políduo; RB = tampão de resuspensão; TOTAL = RNA total; PAR = mRNA associado ao polissomo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudar a regulação da expressão genética no nível translacional é fundamental para compreender melhor diferentes processos biológicos, uma vez que o ponto final da expressão genética celular é a abundância deproteínas 13,14. Isso pode ser avaliado analisando o translatório do tecido ou organismo de interesse para o qual a fração polissômica deve ser purificada e seus mRNAs associados analisaram 3,4,34,35,36.<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pela bolsa CSIC I+D 2020 nº 282, FVF 2017 grant No. 210 e PEDECIBA (María Martha Sainz).
Materials
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
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