تقييم النقل الخلوي المعوي لعزل تجرثم الدم الإشريكية القولونية الوليدي
Summary
تسبب الإشريكية القولونية الإنتان لدى حديثي الولادة الذين يتناولون البكتيريا في وقت قريب من الولادة. العملية التي تنطوي عليها قدرة الإشريكية القولونية على الانتقال من القناة المعوية إلى مجرى الدم غير مفهومة بشكل جيد. يقيم هذا النموذج في المختبر قدرة سلالات الإشريكية القولونية على السفر عبر الخلايا الظهارية المعوية.
Abstract
يبتلع الأطفال حديثو الولادة سلالات الإشريكية القولونية الأمومية التي تستعمر الأمعاء في وقت الولادة تقريبا. تغزو سلالات الإشريكية القولونية ذات القدرة على الانتقال عبر القناة الهضمية مجرى دم المولود الجديد ، مسببة تجرثم الدم الذي يهدد الحياة. تستخدم المنهجية المقدمة هنا الخلايا الظهارية المعوية المستقطبة التي تزرع على إدخالات شبه منفذة لتقييم انتقال الخلايا من عزلات تجرثم الدم الإشريكية القولونية الوليدية في المختبر. تستخدم هذه الطريقة خط الخلايا المعوية T84 الثابت الذي لديه القدرة على النمو حتى التقاء وتشكيل تقاطعات ضيقة و desmosomes. بعد الوصول إلى نقطة التقاء ، تطور الطبقات أحادية T84 الناضجة مقاومة عبر الظهارة (TEER) ، والتي يمكن قياسها باستخدام الفولتميتر. ترتبط قيم TEER عكسيا بنفاذية الخلايا للمكونات خارج الخلية ، بما في ذلك البكتيريا ، عبر الطبقة الأحادية المعوية. من ناحية أخرى ، فإن مرور البكتيريا عبر الخلايا (transcytosis) ، لا يغير بالضرورة قياسات TEER. في هذا النموذج ، يتم تحديد الممر البكتيري عبر الطبقة الأحادية المعوية لمدة تصل إلى 6 ساعات بعد الإصابة ، ويتم إجراء قياسات متكررة ل TEER لمراقبة نفاذية الخلايا شبه الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، تسهل هذه الطريقة استخدام تقنيات مثل التلوين المناعي لدراسة التغيرات الهيكلية في الوصلات الضيقة وغيرها من بروتينات الالتصاق من خلية إلى أخرى أثناء النقل الخلوي البكتيري عبر الظهارة المستقطبة. يساهم استخدام هذا النموذج في توصيف الآليات التي يتم من خلالها نقل الخلايا القولونية الوليدية عبر ظهارة الأمعاء لإنتاج تجرثم الدم.
Introduction
الإشريكية القولونية هي السبب الأكثر شيوعا للإنتان المبكر عند الأطفال حديثي الولادة1،2،3. يمكن أن يصل معدل وفيات تجرثم الدم الإشريكية القولونية الوليدي إلى 40٪ ، والتهاب السحايا هو أحد المضاعفات المحتملة المرتبطة بإعاقات النمو العصبي الشديدة2. يمكن أن يؤدي ابتلاع سلالات الإشريكية القولونية الأمومية من قبل حديثي الولادة إلى تجرثم الدم الوليدي. تم تكرار هذه العملية في النماذج الحيوانية 2,4. بمجرد تناولها ، تنتقل البكتيريا المسببة للأمراض من تجويف الأمعاء الوليدي عبر الحاجز المعوي وتدخل مجرى الدم ، مسببة تسمم الدم. تختلف سلالات الإشريكية القولونية الغازية الوليدية التي تنتج تجرثم الدم في قدرتها على غزو الخلايا الظهارية المعوية 1,5. ومع ذلك ، فإن قدرتها على نقل الخلايا ظهارة الأمعاء بعد الغزو لم يتم توصيفها بالكامل.
يعد نموذج نقل الخلايا المعوية هذا طريقة مفيدة في المختبر لمحاكاة الممر البكتيري عبر ظهارة الأمعاء. الهدف العام من الطرق المقدمة في هذه المخطوطة هو مقارنة قدرة عزلات الإشريكية القولونية الوليدية على نقل الخلايا في ظهارة الأمعاء. يستخدم النموذج الموصوف هنا خلايا T84 ، وهي خلايا غدية معوية بشرية خلدة 6,7. تزرع خلايا T84 لتلتقي على غشاء شبه نافذ مع مقصورتين منفصلتين. الأساس المنطقي لاستخدام هذه التقنية هو أنه ، كما يحدث في الجسم الحي ، تستقطب هذه الخلايا المعوية وتطور تقاطعات ضيقة ناضجة 6,8. يصبح الجانب الملامس للغشاء هو الجانب القاعدي. يصبح الجانب الآخر من الخلايا هو الجانب القمي ، الذي يشبه تجويف الأمعاء حيث تلتصق مسببات الأمراض المبتلعة وتغزو. غشاء transwell قابل للنفاذ للبكتيريا ، لكن الخلايا المعوية المستقطبة تشكل تقاطعات ضيقة ، مما يضعف الحركة البكتيرية شبه الخلوية9. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة ميزة البيئة المختبرية الخاضعة للرقابة باستخدام خط خلية بشرية لدراسة عملية نقل الخلايا البكتيرية ، بما في ذلك الطريق عبر الخلايا. في حين توجد طرق أخرى للتحقيق في انتقال الخلايا للبكتيريا عبر ظهارة الأمعاء ، فإن طريقة transwell المعروضة هنا توفر سهولة أكبر وإمكانية الوصول. تتوفر تقنيات بديلة ، مثل تلك التي تستخدم عينات خارج الجسم الحي تم إعدادها في أنظمة غرفة Using. ومع ذلك ، فإنهم يستخدمون عينات الأنسجة التي قد لا يمكن الوصول إليها بسهولة ، خاصة إذا كان البحث يهدف إلى دراسة علم وظائف الأعضاء البشرية10. تمثل الكائنات العضوية المعوية مثالا آخر على بديل في المختبر لدراسة تفاعلات البكتيريا المضيفة11. بينما يمكن أيضا استخدام أحاديات الطبقات العضوية في نظام transwell لدراسة النقل الخلوي البكتيري ، فإنها تتطلب عزل ونمو الخلايا الجذعية واستخدام عوامل نمو محددة للحث على التمايز12. وبالتالي ، فإن استخدامها يستغرق وقتا أطول ويرتبط بتكاليف أكبر مقارنة بطريقة transwell الموضحة في هذه المخطوطة.
تم إجراء تقييم الممر البكتيري عبر ظهارة الأمعاء باستخدام نظام transwell في المختبر بنجاح لمختلف مسببات الأمراض. وقد أظهرت هذه الدراسات فائدة نظام transwell باستخدام خلايا T84 لتوصيف نقل الخلايا من البكتيريا عبر ظهارة الأمعاء المستقطبة13،14،15. ومع ذلك ، لم يتم وصف تطبيق طريقة transwell هذه لمقارنة قدرة نقل الخلايا لسلالات E. coli الوليدية المنتجة لتجرثم الدم بالتفصيل. توفر هذه المخطوطة للباحثين الآخرين بروتوكولا قياسيا للترانسويل موثوقا به وسهل الاستخدام ولا يتطلب موارد باهظة الثمن.
لمقارنة قدرة سلالات الإشريكية القولونية الغازية لحديثي الولادة على نقل الخلايا في ظهارة الأمعاء ، يمكن أن يصاب الجانب القمي من الطبقة الأحادية الظهارية المعوية بعدد معروف من الخلايا البكتيرية. بعد الحضانة ، يمكن جمع الوسط الموجود على الجانب القاعدي من الظهارة وتحديد كمية البكتيريا لتحديد كمية النقل الخلوي البكتيري بمرور الوقت. في هذه المخطوطة ، يتم استخدام الطرق المقدمة لدراسة قدرة نقل الخلايا للسلالات السريرية الوليدية E. coli المستعادة من الأطفال حديثي الولادة الذين تم إدخالهم إلى المستشفى بسبب تجرثم الدم. تم نشر معايير الإدراج لاختيار هذه العزلات السريرية لحديثي الولادة لدراسات نقل الخلايا سابقا1،2،16. عندما يتم تنفيذ هذه الطريقة باستخدام سلالات مختلفة من الإشريكية القولونية ، يمكن مقارنة قدراتها على نقل الخلايا. من خلال هذه العملية ، يوفر نموذج نقل الخلايا المعوية بيانات قيمة لتوصيف عوامل ضراوة الإشريكية القولونية التي تساهم في العملية متعددة الخطوات التي تتوج بتطور تجرثم الدم الوليدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الطريقة مشتقة من التقنيات المستخدمة في أمراض الجهاز الهضمي والأمراض المعدية20. تم استخدام نماذج في المختبر للحاجز الظهاري المعوي لتوضيح الآليات التي تتفاعل بها المحتويات اللمعية مع هذا المكون ذي الصلة من المناعة الفطرية 6,8. كما تم تمي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة سارة موريسون الطلابية الصادرة عن كلية الطب بجامعة ميسوري-كانساس سيتي إلى الذكاء الاصطناعي.
Materials
| 10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
| 2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
| 50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Aspirator | Corning | 4930 | |
| Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
| Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
| Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
| Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
| Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
| Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
| Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
| Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
| Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
| T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
| Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
| Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
| Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |
References
- Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
- Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
- Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
- Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
- Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
- Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
- Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
- Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
- Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
- Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology – A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
- Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
- Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
- Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
- Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
- Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
- Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
- den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
- Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
- Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
- Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
- Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
- McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
- Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
- Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
- El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
- Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
- Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
- Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6′-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
- Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
- Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
- McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
- Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).
