Summary

新生児大腸 分離株の腸管トランスサイトーシスの評価

Published: February 17, 2023
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Summary

大腸菌は、出生前後に細菌を摂取した新生児に敗血症を引き起こします。大腸が腸管から血流に移動する能力に関与するプロセスは、よく理解されていません。このin vitroモデルは、大腸菌株が腸上皮細胞を通過する能力を評価します。

Abstract

新生児は、出産前後に腸管にコロニーを形成する母体の大腸菌株を摂取します。腸内を移動する能力を持つ大腸菌株は、新生児の血流に侵入し、生命を脅かす血症を引き起こします。ここで紹介する方法論は、半透性インサート上で増殖させた分極腸上皮細胞を利用して、in vitroで新生児大腸菌血症分離株のトランスサイトーシスを評価します。この方法は、コンフルエントに成長し、タイトジャンクションとデスモソームを形成する能力を有する確立されたT84腸細胞株を使用します。コンフルエントに達した後、成熟したT84単層は経上皮抵抗(TEER)を発症し、電圧計を使用して定量化できます。TEER値は、腸単層を横切る細菌を含む細胞外成分の傍細胞透過性と逆相関しています。一方、細菌の経細胞通過(トランスサイトーシス)は、必ずしもTEER測定値を変化させるわけではありません。このモデルでは、腸単層を横切る細菌の通過が感染後最大6時間定量化され、傍細胞透過性を監視するためにTEERの繰り返し測定が行われます。さらに、この方法は、分極上皮を横切る細菌トランスサイトーシス中のタイトジャンクションおよび他の細胞間接着タンパク質の構造変化を研究するための免疫染色などの技術の使用を容易にします。このモデルの使用は、新生児大腸が腸上皮を横切って菌血症を引き起こすメカニズムの特性評価に貢献します。

Introduction

大腸菌は、新生児の早期発症型敗血症の最も一般的な原因です123新生児大腸菌血症の死亡率は40%に達する可能性があり、髄膜炎は重度の神経発達障害に関連する可能性のある合併症です2。新生児による母体の大腸菌株の摂取は、新生児血症を引き起こす可能性があります。このプロセスは、動物モデル24で再現されています。摂取されると、病原菌は新生児の腸管腔から腸関門を越えて血流に入り、敗血症を引き起こします。菌血症を産生する新生児侵襲性大腸菌株は、腸上皮細胞に侵入する能力が異なる1,5。しかしながら、浸潤後に腸上皮をトランスサイトーゼするそれらの能力は完全には特徴付けられていない。

この腸管トランスサイトーシスモデルは、腸上皮を横切る細菌の通過をエミュレートするための有用なin vitro法である。この原稿で提示された方法の全体的な目標は、腸上皮をトランスサイトーゼする新生児大腸菌分離物の能力を比較することです。ここで説明するモデルは、不死化ヒト腸腺癌細胞であるT84細胞を利用する6,7。T84細胞は、2つの別々のコンパートメントを有する半透膜上でコンフルエントに増殖する。この技術を使用する理論的根拠は、in vivoで起こるように、これらの腸細胞が分極し、成熟したタイトジャンクションを発達させることです6,8。膜と接触する側が基底側となる。細胞の反対側は頂端側になり、摂取された病原体が付着して侵入する腸管腔に似ています。トランスウェル膜は細菌に対して透過性ですが、分極した腸細胞はタイトジャンクションを形成し、細菌の傍細胞運動を損ないます9。したがって、この方法は、経細胞経路を含む細菌性トランスサイトーシスの過程を研究するためにヒト細胞株を利用する制御されたインビトロ環境の利点を提供する。腸上皮を横切る細菌のトランスサイトーシスを調査するための他の方法が存在するが、ここで紹介するトランスウェル法は、より容易でアクセスしやすい方法を提供する。Ussingチャンバーシステムに設置されたex vivoサンプルを利用する技術などの代替技術が利用可能です。ただし、特に研究が人間の生理学を研究することを意図している場合は、簡単にアクセスできない可能性のある組織標本を利用します10。腸管オルガノイドは、宿主-細菌相互作用を研究するためのin vitro代替物の別の例を表しています11。オルガノイド単分子膜は、細菌のトランスサイトーシスを研究するためにトランスウェルシステムでも使用できますが、幹細胞の単離と増殖、および分化を誘導するための特定の成長因子の使用が必要です12。したがって、それらの使用は、この原稿に記載されているトランスウェル法と比較して、より時間がかかり、より大きなコストを伴う。

このin vitroトランスウェルシステムを用いた腸上皮を横切る細菌の通過の評価は、様々な病原体に対して成功裏に行われている。これらの研究は、分極した腸上皮を横切る細菌のトランスサイトーシスを特徴付けるためにT84細胞を使用するトランスウェルシステムの有用性を示しています131415。しかしながら、菌血症産生新生児大腸菌株のトランスサイトーシス能を比較するためのこのトランスウェル法の適用は詳細に説明されていない。この原稿は、信頼性が高く使いやすく、高すぎるリソースを必要としない標準的なTranswellプロトコルを他の研究者に提供します。

腸上皮をトランスサイトーゼする新生児侵襲性 大腸菌 株の能力を比較するために、腸上皮単層の頂端側に、既知の数の細菌細胞を感染させることができる。インキュベーション後、上皮の基底側の培地を回収し、細菌を定量して、細菌トランスサイトーシスの量を経時的に決定することができます。この原稿では、提示された方法を利用して、菌血症で入院した新生児から回収された新生児 大腸菌 臨床株のトランスサイトーシス能力を研究しています。トランスサイトーシス研究のためのこれらの新生児臨床分離株の選択のための選択基準は、以前に公開されている1216。この方法が異なる 大腸菌 株を用いて行われる場合、それらのトランスサイトーシス能力を比較することができる。このプロセスを通じて、腸管トランスサイトーシスモデルは、新生児菌血症の発症に至る多段階のプロセスに寄与する 大腸菌 の病原性因子を特徴付けるための貴重なデータを提供します。

Protocol

注意: 汚染を避けるために、バイオセーフティレベル2(BSL-2)の安全キャビネットでT84細胞、細菌、プレート、および試薬のすべての操作を実行してください。滅菌T84細胞、感染したT84細胞、および大腸菌を含むすべての作業には、別々のエリアとインキュベーターを使用してください。ここに記載されている方法でテストされた臨床大腸菌分離株は、私たちの施設の治験審査委員…

Representative Results

図1:T84は時間の経過とともに変化します。 T84セル層がインサート上で成熟するにつれて、単層の電気抵抗が増加します。少なくとも1,000 Ω・cm2のTEERでは、細胞層は、傍細胞細菌輸送を減少させ、主に経細胞細菌輸送の測定を可能にするのに十分に発達し?…

Discussion

この方法は、消化器病学および感染症20で使用される技術に由来します。腸管上皮バリアのin vitroモデルは、管腔内容物が自然免疫のこの関連成分と相互作用するメカニズムを解明するために使用されています6,8。侵襲性新生児大腸菌の宿主と病原体の相互作用も、遺伝子分析、抗菌薬耐性の研究、および免疫学的手?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、ミズーリ大学カンザスシティ医学部がAIに発行したサラモリソン学生助成金によってサポートされました。

Materials

10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture Fisher Scientific 15-140-122
15 mL sterile conical tubes MidSci C15B
2 mL microcentrifuge tubes Avant AVSS2000
50 mL sterile polypropylene conical tubes Falcon 352070
Aspirator Corning 4930
Biosafety Cabinets Labconco 30441010028343 Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work.
Centrifuge Sorvall Legend RT
Disposable inoculation loops Fisherbrand 22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-084
Epithelial Volt/Ohm Meter World Precision Instruments EVOM
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11765-047
Hemacytometer Sigma Aldrich, Bright Line Z359629
Incubator shaker New Brunswick Innova 4080
Incubators Thermo Scientific 51030284 Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation.
Lysogeny broth Difco 244610
Lysogeny broth agar IBI Scientific IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscope Nikon
Spectrophotometer Unico 1100RS
T84 Intestinal Cells American Tissue Culture Collection CCL248
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores,  24 well format Falcon 353096
Tissue culture plate, 24 wells Falcon 353504
Trypan blue stain Fisher Scientific T10282

References

  1. Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
  2. Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
  3. Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
  4. Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
  5. Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
  6. Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
  7. Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
  8. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
  9. Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
  10. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  11. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology – A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  12. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
  13. Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
  14. Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
  15. Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
  16. Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
  17. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  18. den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
  19. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  20. Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
  21. Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
  22. Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
  23. McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
  24. Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
  25. Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
  26. El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
  27. Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
  28. Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
  29. Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6′-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
  30. Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
  31. Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
  32. McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
  33. Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).

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Cite This Article
Islam, A., Wheatley, J. L., Chavez-Bueno, S. Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates. J. Vis. Exp. (192), e64241, doi:10.3791/64241 (2023).

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