Escherichia coli גורם אלח דם בילודים אשר בולעים את החיידקים סביב זמן הלידה. התהליך הכרוך ביכולתו של E. coli לנוע מהמערכת האנטרית לזרם הדם אינו מובן היטב. מודל זה במבחנה מעריך את יכולתם של זני E. coli לנוע דרך תאי אפיתל המעי.
תינוקות בולעים זני E. coli אימהיים המאכלסים את מערכת העיכול שלהם סביב זמן הלידה. זני E. coli בעלי יכולת טרנסלוקציה על פני המעיים פולשים לזרם הדם של היילוד, וגורמים לחיידקים מסכני חיים. המתודולוגיה המוצגת כאן משתמשת בתאי אפיתל מעיים מקוטבים הגדלים על תוספות חצי-חדירות כדי להעריך את הטרנסציטוזה של חיידק E. coli מבודד במבחנה. שיטה זו משתמשת בקו תאי המעי T84 שהוקם שיש לו את היכולת לגדול למפגש וליצור צמתים הדוקים ודמוזומים. לאחר ההגעה למפגש, מונו-שכבות T84 בוגרות מפתחות התנגדות טרנס-אפיתליאלית (TEER), אותה ניתן לכמת באמצעות מד מתח. ערכי TEER נמצאים בקורלציה הפוכה עם החדירות העל-תאית של רכיבים חוץ-תאיים, כולל חיידקים, על-פני שכבת המעיים. המעבר הטרנס-תאי של חיידקים (טרנסציטוזה), לעומת זאת, אינו משנה בהכרח את מדידות ה- TEER. במודל זה, מעבר חיידקים על פני מונולאייר המעי מכמת עד 6 שעות לאחר ההדבקה, ומדידות חוזרות ונשנות של TEER נעשות כדי לנטר את החדירות הפרה-תאית. בנוסף, שיטה זו מקלה על השימוש בטכניקות כגון immunostaining כדי לחקור את השינויים המבניים בצמתים הדוקים וחלבוני הידבקות אחרים מתא לתא במהלך טרנסציטוזה חיידקית על פני אפיתל מקוטב. השימוש במודל זה תורם לאפיון המנגנונים שבאמצעותם E. coli transcytose ילודים על פני אפיתל המעי לייצר חיידקים.
Escherichia coli הוא הגורם השכיח ביותר של אלח דם מוקדם בתינוקות 1,2,3. שיעור התמותה של חיידק E. coli ילודים יכול להגיע ל -40%, ודלקת קרום המוח היא סיבוך אפשרי הקשור לנכויות נוירו-התפתחותיות חמורות2. בליעה של זני E. coli אימהיים על ידי התינוק יכולה לייצר חיידק ילודים; תהליך זה שוכפל במודלים של בעלי חיים 2,4. לאחר בליעתם, חיידקים פתוגניים עוברים מלומן המעי היילודים על פני מחסום המעי ונכנסים לזרם הדם, מה שגורם לספטיצמיה. זני E. coli פולשניים המייצרים חיידקים שונים ביכולתם לפלוש לתאי אפיתל במעיים 1,5. עם זאת, היכולת שלהם transcytose אפיתל המעי לאחר הפלישה לא היה מאופיין לחלוטין.
מודל זה של טרנסציטוזה במעיים הוא שיטה שימושית במבחנה לחיקוי מעבר חיידקים על פני אפיתל המעי. המטרה הכוללת של השיטות המוצגות בכתב יד זה היא להשוות את היכולת של E. coli מבודד ילודים כדי transcytose אפיתל המעי. המודל המתואר כאן משתמש בתאי T84, שהם תאי אדנוקרצינומה של המעי האנושי 6,7. תאי T84 גדלים למפגש על קרום חצי-חדיר עם שני תאים נפרדים. הרציונל לשימוש בטכניקה זו הוא, כפי שקורה in vivo, תאי מעיים אלה מקטבים ומפתחים צמתים הדוקים בוגרים 6,8. הצד במגע עם הממברנה הופך לצד הבסיסי. הצד הנגדי של התאים הופך לצד האפי, הדומה לומן המעיים שבו פתוגנים שנבלעו נדבקים ופולשים. קרום הטרנסוול חדיר לחיידקים, אך תאי המעי המקוטבים יוצרים צמתים הדוקים, הפוגעים בתנועה העל-תאית של החיידקים9. לפיכך, שיטה זו מספקת את היתרון של סביבה מבוקרת במבחנה המשתמשת בקו תאים אנושי כדי לחקור את תהליך הטרנסציטוזה החיידקית, כולל המסלול הטרנס-תאי. בעוד שקיימות שיטות אחרות לחקור את הטרנסציטוזה של חיידקים על פני אפיתל המעי, שיטת הטרנסוול המוצגת כאן מספקת קלות ונגישות רבה יותר. קיימות טכניקות חלופיות, כגון אלה המשתמשות בדגימות ex vivo המוגדרות במערכות תא של Ussing. עם זאת, הם משתמשים בדגימות רקמה שעשויות שלא להיות נגישות בקלות, במיוחד אם המחקר מתכוון לחקור את הפיזיולוגיה האנושית10. אורגנואידים במעיים מייצגים דוגמה נוספת לחלופה חוץ-גופית לחקר אינטראקציות בין חיידקים מארחים11. בעוד שמונו-שכבות אורגנואידיות יכולות לשמש גם במערכת הטרנסוול כדי לחקור טרנסציטוזה חיידקית, הן דורשות בידוד וצמיחה של תאי גזע ושימוש בגורמי גדילה ספציפיים כדי לגרום להתמיינות12. לפיכך, השימוש בהם גוזל זמן רב יותר וכרוך בעלויות גבוהות יותר בהשוואה לשיטת טרנסוול המתוארת בכתב יד זה.
ההערכה של מעבר חיידקים על פני אפיתל המעי באמצעות מערכת זו in vitro transwell בוצעה בהצלחה עבור פתוגנים שונים. מחקרים אלה הראו את התועלת של מערכת טרנסוול המשתמשת בתאי T84 כדי לאפיין את הטרנסציטוזה של חיידקים על פני אפיתל המעי המקוטב13,14,15. עם זאת, היישום של שיטת טרנסוול זו להשוואת יכולת הטרנסציטוזה של זני E. coli המייצרים חיידקים לא תואר בפירוט. כתב יד זה מספק לחוקרים אחרים פרוטוקול טרנסוול סטנדרטי שהוא אמין וקל לשימוש ואינו דורש משאבים יקרים מדי.
כדי להשוות את היכולת של זני E. coli פולשניים ילודים לבצע טרנסציטוזה של אפיתל המעי, הצד האפי של שכבת האפיתל במעיים יכול להיות נגוע במספר ידוע של תאי חיידקים. לאחר הדגירה, ניתן לאסוף את המדיום בצד הבסיסי של האפיתל ולכמת את החיידקים כדי לקבוע את כמות הטרנסציטוזה החיידקית לאורך זמן. בכתב יד זה, השיטות המוצגות משמשות לחקר יכולת הטרנסציטוזה של זנים קליניים של E. coli ילודים שהחלימו מתינוקות המאושפזים עם חיידקים. קריטריוני ההכללה לבחירת מבודדים קליניים יילודים אלה למחקרי טרנסציטוזה פורסמו בעבר 1,2,16. כאשר שיטה זו מבוצעת באמצעות זנים שונים של E. coli, ניתן להשוות את יכולות הטרנסציטוזה שלהם. באמצעות תהליך זה, מודל transcytosis המעי מספק נתונים חשובים כדי לאפיין את גורמי virulence של E. coli התורמים לתהליך multistep שמגיע לשיאו בהתפתחות של חיידק ילודים.
שיטה זו נגזרת מטכניקות המשמשות בגסטרואנטרולוגיה ומחלות זיהומיות20. מודלים במבחנה של מחסום אפיתל המעי שימשו כדי להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם התוכן הזוהר אינטראקציה עם מרכיב רלוונטי זה של חסינות מולדת 6,8. האינטראקציות בין המארח לפתוגן של <…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק סטודנטים של שרה מוריסון שהונפק על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מיזורי-קנזס סיטי ל- A.I.
10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
15 mL sterile conical tubes | MidSci | C15B | |
2 mL microcentrifuge tubes | Avant | AVSS2000 | |
50 mL sterile polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
Aspirator | Corning | 4930 | |
Biosafety Cabinets | Labconco | 30441010028343 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work. |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Disposable inoculation loops | Fisherbrand | 22363605 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-084 | |
Epithelial Volt/Ohm Meter | World Precision Instruments | EVOM | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 10437028 | |
Ham's F-12 Nutrient Mixture | Gibco | 11765-047 | |
Hemacytometer | Sigma Aldrich, Bright Line | Z359629 | |
Incubator shaker | New Brunswick | Innova 4080 | |
Incubators | Thermo Scientific | 51030284 | Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation. |
Lysogeny broth | Difco | 244610 | |
Lysogeny broth agar | IBI Scientific | IB49101 | |
Nikon Eclipse TS2R Microscope | Nikon | ||
Spectrophotometer | Unico | 1100RS | |
T84 Intestinal Cells | American Tissue Culture Collection | CCL248 | |
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores, 24 well format | Falcon | 353096 | |
Tissue culture plate, 24 wells | Falcon | 353504 | |
Trypan blue stain | Fisher Scientific | T10282 |