Summary

הערכה של טרנסציטוזה מעיים של חיידקי חיידקי חיידקי Escherichia coli ילודים

Published: February 17, 2023
doi:

Summary

Escherichia coli גורם אלח דם בילודים אשר בולעים את החיידקים סביב זמן הלידה. התהליך הכרוך ביכולתו של E. coli לנוע מהמערכת האנטרית לזרם הדם אינו מובן היטב. מודל זה במבחנה מעריך את יכולתם של זני E. coli לנוע דרך תאי אפיתל המעי.

Abstract

תינוקות בולעים זני E. coli אימהיים המאכלסים את מערכת העיכול שלהם סביב זמן הלידה. זני E. coli בעלי יכולת טרנסלוקציה על פני המעיים פולשים לזרם הדם של היילוד, וגורמים לחיידקים מסכני חיים. המתודולוגיה המוצגת כאן משתמשת בתאי אפיתל מעיים מקוטבים הגדלים על תוספות חצי-חדירות כדי להעריך את הטרנסציטוזה של חיידק E. coli מבודד במבחנה. שיטה זו משתמשת בקו תאי המעי T84 שהוקם שיש לו את היכולת לגדול למפגש וליצור צמתים הדוקים ודמוזומים. לאחר ההגעה למפגש, מונו-שכבות T84 בוגרות מפתחות התנגדות טרנס-אפיתליאלית (TEER), אותה ניתן לכמת באמצעות מד מתח. ערכי TEER נמצאים בקורלציה הפוכה עם החדירות העל-תאית של רכיבים חוץ-תאיים, כולל חיידקים, על-פני שכבת המעיים. המעבר הטרנס-תאי של חיידקים (טרנסציטוזה), לעומת זאת, אינו משנה בהכרח את מדידות ה- TEER. במודל זה, מעבר חיידקים על פני מונולאייר המעי מכמת עד 6 שעות לאחר ההדבקה, ומדידות חוזרות ונשנות של TEER נעשות כדי לנטר את החדירות הפרה-תאית. בנוסף, שיטה זו מקלה על השימוש בטכניקות כגון immunostaining כדי לחקור את השינויים המבניים בצמתים הדוקים וחלבוני הידבקות אחרים מתא לתא במהלך טרנסציטוזה חיידקית על פני אפיתל מקוטב. השימוש במודל זה תורם לאפיון המנגנונים שבאמצעותם E. coli transcytose ילודים על פני אפיתל המעי לייצר חיידקים.

Introduction

Escherichia coli הוא הגורם השכיח ביותר של אלח דם מוקדם בתינוקות 1,2,3. שיעור התמותה של חיידק E. coli ילודים יכול להגיע ל -40%, ודלקת קרום המוח היא סיבוך אפשרי הקשור לנכויות נוירו-התפתחותיות חמורות2. בליעה של זני E. coli אימהיים על ידי התינוק יכולה לייצר חיידק ילודים; תהליך זה שוכפל במודלים של בעלי חיים 2,4. לאחר בליעתם, חיידקים פתוגניים עוברים מלומן המעי היילודים על פני מחסום המעי ונכנסים לזרם הדם, מה שגורם לספטיצמיה. זני E. coli פולשניים המייצרים חיידקים שונים ביכולתם לפלוש לתאי אפיתל במעיים 1,5. עם זאת, היכולת שלהם transcytose אפיתל המעי לאחר הפלישה לא היה מאופיין לחלוטין.

מודל זה של טרנסציטוזה במעיים הוא שיטה שימושית במבחנה לחיקוי מעבר חיידקים על פני אפיתל המעי. המטרה הכוללת של השיטות המוצגות בכתב יד זה היא להשוות את היכולת של E. coli מבודד ילודים כדי transcytose אפיתל המעי. המודל המתואר כאן משתמש בתאי T84, שהם תאי אדנוקרצינומה של המעי האנושי 6,7. תאי T84 גדלים למפגש על קרום חצי-חדיר עם שני תאים נפרדים. הרציונל לשימוש בטכניקה זו הוא, כפי שקורה in vivo, תאי מעיים אלה מקטבים ומפתחים צמתים הדוקים בוגרים 6,8. הצד במגע עם הממברנה הופך לצד הבסיסי. הצד הנגדי של התאים הופך לצד האפי, הדומה לומן המעיים שבו פתוגנים שנבלעו נדבקים ופולשים. קרום הטרנסוול חדיר לחיידקים, אך תאי המעי המקוטבים יוצרים צמתים הדוקים, הפוגעים בתנועה העל-תאית של החיידקים9. לפיכך, שיטה זו מספקת את היתרון של סביבה מבוקרת במבחנה המשתמשת בקו תאים אנושי כדי לחקור את תהליך הטרנסציטוזה החיידקית, כולל המסלול הטרנס-תאי. בעוד שקיימות שיטות אחרות לחקור את הטרנסציטוזה של חיידקים על פני אפיתל המעי, שיטת הטרנסוול המוצגת כאן מספקת קלות ונגישות רבה יותר. קיימות טכניקות חלופיות, כגון אלה המשתמשות בדגימות ex vivo המוגדרות במערכות תא של Ussing. עם זאת, הם משתמשים בדגימות רקמה שעשויות שלא להיות נגישות בקלות, במיוחד אם המחקר מתכוון לחקור את הפיזיולוגיה האנושית10. אורגנואידים במעיים מייצגים דוגמה נוספת לחלופה חוץ-גופית לחקר אינטראקציות בין חיידקים מארחים11. בעוד שמונו-שכבות אורגנואידיות יכולות לשמש גם במערכת הטרנסוול כדי לחקור טרנסציטוזה חיידקית, הן דורשות בידוד וצמיחה של תאי גזע ושימוש בגורמי גדילה ספציפיים כדי לגרום להתמיינות12. לפיכך, השימוש בהם גוזל זמן רב יותר וכרוך בעלויות גבוהות יותר בהשוואה לשיטת טרנסוול המתוארת בכתב יד זה.

ההערכה של מעבר חיידקים על פני אפיתל המעי באמצעות מערכת זו in vitro transwell בוצעה בהצלחה עבור פתוגנים שונים. מחקרים אלה הראו את התועלת של מערכת טרנסוול המשתמשת בתאי T84 כדי לאפיין את הטרנסציטוזה של חיידקים על פני אפיתל המעי המקוטב13,14,15. עם זאת, היישום של שיטת טרנסוול זו להשוואת יכולת הטרנסציטוזה של זני E. coli המייצרים חיידקים לא תואר בפירוט. כתב יד זה מספק לחוקרים אחרים פרוטוקול טרנסוול סטנדרטי שהוא אמין וקל לשימוש ואינו דורש משאבים יקרים מדי.

כדי להשוות את היכולת של זני E. coli פולשניים ילודים לבצע טרנסציטוזה של אפיתל המעי, הצד האפי של שכבת האפיתל במעיים יכול להיות נגוע במספר ידוע של תאי חיידקים. לאחר הדגירה, ניתן לאסוף את המדיום בצד הבסיסי של האפיתל ולכמת את החיידקים כדי לקבוע את כמות הטרנסציטוזה החיידקית לאורך זמן. בכתב יד זה, השיטות המוצגות משמשות לחקר יכולת הטרנסציטוזה של זנים קליניים של E. coli ילודים שהחלימו מתינוקות המאושפזים עם חיידקים. קריטריוני ההכללה לבחירת מבודדים קליניים יילודים אלה למחקרי טרנסציטוזה פורסמו בעבר 1,2,16. כאשר שיטה זו מבוצעת באמצעות זנים שונים של E. coli, ניתן להשוות את יכולות הטרנסציטוזה שלהם. באמצעות תהליך זה, מודל transcytosis המעי מספק נתונים חשובים כדי לאפיין את גורמי virulence של E. coli התורמים לתהליך multistep שמגיע לשיאו בהתפתחות של חיידק ילודים.

Protocol

הערה: בצע את כל המניפולציות של תאי T84, חיידקים, צלחות וריאגנטים בארון בטיחות Biosafety רמה 2 (BSL-2) כדי למנוע זיהום. השתמש באזורים נפרדים ובאינקובטורים לכל העבודה הכוללת תאי T84 סטריליים, תאי T84 נגועים ו- E. coli. מבודדי E. coli הקליניים שנבדקו בשיטות המתוארות כאן התקבלו בהתאם להנחיות מועצת הביקו?…

Representative Results

איור 1: T84 TEER לאורך זמן. ככל ששכבת התא T84 מתבגרת על התוספת, ההתנגדות החשמלית של המונולאייר גדלה. ב-TEER של לפחות 1,000 Ω·ס”מ2, שכבת התא מפותחת מספיק כדי להקטין את הובלת החיידקים העל-תאיים ולאפשר מד?…

Discussion

שיטה זו נגזרת מטכניקות המשמשות בגסטרואנטרולוגיה ומחלות זיהומיות20. מודלים במבחנה של מחסום אפיתל המעי שימשו כדי להבהיר את המנגנונים שבאמצעותם התוכן הזוהר אינטראקציה עם מרכיב רלוונטי זה של חסינות מולדת 6,8. האינטראקציות בין המארח לפתוגן של <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק סטודנטים של שרה מוריסון שהונפק על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מיזורי-קנזס סיטי ל- A.I.

Materials

10,000 U/ mL Penicillin/Streptomycin Mixture Fisher Scientific 15-140-122
15 mL sterile conical tubes MidSci C15B
2 mL microcentrifuge tubes Avant AVSS2000
50 mL sterile polypropylene conical tubes Falcon 352070
Aspirator Corning 4930
Biosafety Cabinets Labconco 30441010028343 Three of these are used in the method: one for sterile tissue work, one for infected tissue work, and one for bacterial work.
Centrifuge Sorvall Legend RT
Disposable inoculation loops Fisherbrand 22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-084
Epithelial Volt/Ohm Meter World Precision Instruments EVOM
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10437028
Ham's F-12 Nutrient Mixture Gibco 11765-047
Hemacytometer Sigma Aldrich, Bright Line Z359629
Incubator shaker New Brunswick Innova 4080
Incubators Thermo Scientific 51030284 Three of these are used in the method: one for sterile tissue culturing, one for infected tissue culturing, and one for bacterial incubation.
Lysogeny broth Difco 244610
Lysogeny broth agar IBI Scientific IB49101
Nikon Eclipse TS2R Microscope Nikon
Spectrophotometer Unico 1100RS
T84 Intestinal Cells American Tissue Culture Collection CCL248
Tissue culture inserts, with polyethylene trephthalate membrane, 3 µm pores,  24 well format Falcon 353096
Tissue culture plate, 24 wells Falcon 353504
Trypan blue stain Fisher Scientific T10282

References

  1. Shakir, S. M., Goldbeck, J. M., Robison, D., Eckerd, A. M., Chavez-Bueno, S. Genotypic and phenotypic characterization of invasive neonatal Escherichia coli clinical isolates. American Journal of Perinatology. 31 (11), 975-982 (2014).
  2. Cole, B. K., et al. Route of infection alters virulence of neonatal septicemia Escherichia coli clinical isolates. PloS One. 12 (12), 0189032 (2017).
  3. Stoll, B. J., et al. Early-onset neonatal sepsis 2015 to 2017, the rise of Escherichia coli, and the need for novel prevention strategies. Journal of the American Medical Association Pediatrics. 174 (7), 200593 (2020).
  4. Dalgakiran, F., Witcomb, L. A., McCarthy, A. J., Birchenough, G. M., Taylor, P. W. Non-invasive model of neuropathogenic Escherichia coli infection in the neonatal rat. Journal of Visualized Experiments. (92), e52018 (2014).
  5. Williams, M., et al. Whole-genome sequencing-based phylogeny, antibiotic resistance, and invasive phenotype of Escherichia coli strains colonizing the cervix of women in preterm labor. BMC Microbiology. 21 (1), 330 (2021).
  6. Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (2020).
  7. Devriese, S., et al. T84 monolayers are superior to Caco-2 as a model system of colonocytes. Histochemistry and Cell Biology. 148 (1), 85-93 (2017).
  8. Buckley, A., Turner, J. R. Cell biology of tight junction barrier regulation and mucosal disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), 029314 (2018).
  9. Awad, W. A., Hess, C., Hess, M. Enteric pathogens and their toxin-induced disruption of the intestinal barrier through alteration of tight junctions in chickens. Toxins. 9 (2), 60 (2017).
  10. Vancamelbeke, M., Vermeire, S. The intestinal barrier: A fundamental role in health and disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).
  11. Aguilar, C., et al. Organoids as host models for infection biology – A review of methods. Experimental and Molecular Medicine. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  12. Nickerson, K. P., et al. A versatile human intestinal organoid-derived epithelial monolayer model for the study of enteric pathogens. Microbiology Spectrum. 9 (1), 0000321 (2021).
  13. Gavin, H. E., Beubier, N. T., Satchell, K. J. The effector domain region of the Vibrio vulnificus MARTX toxin confers biphasic epithelial barrier disruption and is essential for systemic spread from the intestine. PLoS Pathogens. 13 (1), 1006119 (2017).
  14. Kobayashi, H., et al. Aeromonas sobria serine protease decreases epithelial barrier function in T84 cells and accelerates bacterial translocation across the T84 monolayer in vitro. PloS One. 14 (8), 0221344 (2019).
  15. Kalischuk, L. D., Inglis, G. D., Buret, A. G. Campylobacter jejuni induces transcellular translocation of commensal bacteria via lipid rafts. Gut Pathogens. 1 (1), 2 (2009).
  16. Cole, B. K., Ilikj, M., McCloskey, C. B., Chavez-Bueno, S. Antibiotic resistance and molecular characterization of bacteremia Escherichia coli isolates from newborns in the United States. PloS One. 14 (7), 0219352 (2019).
  17. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  18. den Hartog, G., et al. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 restricts the internalization of bacteria into human intestinal epithelial cells through the inhibition of Rac1. Frontiers in Immunology. 11, 553994 (2020).
  19. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. Biotechniques. 23 (4), 648-650 (1997).
  20. Lievin-Le Moal, V., Servin, A. L. Pathogenesis of human enterovirulent bacteria: Lessons from cultured, fully differentiated human colon cancer cell lines. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (3), 380-439 (2013).
  21. Kaczmarek, A., Budzynska, A., Gospodarek, E. Detection of K1 antigen of Escherichia coli rods isolated from pregnant women and neonates. Folia Microbiologica. 59 (5), 419-422 (2014).
  22. Kalita, A., Hu, J., Torres, A. G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli. Current Opinion in Infectious Diseases. 27 (5), 459-464 (2014).
  23. McCool, D. J., Marcon, M. A., Forstner, J. F., Forstner, G. G. The T84 human colonic adenocarcinoma cell line produces mucin in culture and releases it in response to various secretagogues. Biochemical Journal. 267 (2), 491-500 (1990).
  24. Resta-Lenert, S., Barrett, K. E. Enteroinvasive bacteria alter barrier and transport properties of human intestinal epithelium: Role of iNOS and COX-2. Gastroenterology. 122 (4), 1070-1087 (2002).
  25. Elatrech, I., et al. Escherichia coli LF82 differentially regulates ROS production and mucin expression in intestinal epithelial T84 cells: Implication of NOX1. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (5), 1018-1026 (2015).
  26. El-Aouar Filho, R. A., et al. Heterogeneous family of cyclomodulins: Smart weapons that allow bacteria to hijack the eukaryotic cell cycle and promote infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 208 (2017).
  27. Hopkins, A. M., Walsh, S. V., Verkade, P., Boquet, P., Nusrat, A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and epithelial barrier function. Journal of Cell Science. 116, 725-742 (2003).
  28. Shiou, S. R., et al. Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis. Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).
  29. Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6′-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo. Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).
  30. Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1. Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).
  31. Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples. Micromachines. 12 (3), 282 (2021).
  32. McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum. Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698 (2018).
  33. Sayoc-Becerra, A., et al. The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction. Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).

Play Video

Cite This Article
Islam, A., Wheatley, J. L., Chavez-Bueno, S. Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates. J. Vis. Exp. (192), e64241, doi:10.3791/64241 (2023).

View Video