網膜組織における免疫染色カスパーゼ-9の定量
Summary
ここでは、複雑な組織における機能的に関連するカスパーゼを同定、検証、標的化するための詳細な免疫組織化学プロトコルを示します。
Abstract
カスパーゼのファミリーは、細胞分化、軸索経路探索、増殖など、細胞死以外の多くの細胞経路を媒介することが知られています。細胞死プロテアーゼのファミリーの同定以来、発生、健康、および疾患状態における特定のファミリーメンバーの機能を特定および拡張するためのツールが検索されてきました。しかしながら、広く使用されている現在市販されているカスパーゼツールの多くは、標的カスパーゼに特異的ではない。このレポートでは、新しい阻害剤と免疫組織化学的読み出しによる遺伝的アプローチを使用して、神経系のカスパーゼ-9を同定、検証、および標的にするために使用したアプローチについて説明します。具体的には、網膜神経組織をモデルとして、カスパーゼの存在と機能を特定および検証しました。このアプローチは、細胞型特異的なアポトーシスおよび非アポトーシスカスパーゼ-9機能の調査を可能にし、関心のある他の複雑な組織およびカスパーゼに適用することができます。カスパーゼの機能を理解することは、細胞生物学における現在の知識を広げるのに役立ち、また、カスパーゼが疾患に関与しているため、潜在的な治療標的を特定するのにも有利です。
Introduction
カスパーゼは、疾患における発生細胞死、免疫応答、および異常な細胞死を調節するプロテアーゼのファミリーです1,2。カスパーゼファミリーのメンバーがさまざまな神経変性疾患に誘導されることはよく知られていますが、どのカスパーゼが疾患の病理を引き起こすかを理解することはより困難です3。このような研究には、個々のカスパーゼファミリーメンバーの機能を特定、特徴付け、および検証するためのツールが必要です。文献にはカスパーゼの多様な役割の証拠を提供する複数の研究があるため、関連する個々のカスパーゼを解析することは、機構と治療の両方の観点から重要です4,5。したがって、治療上の利益のために疾患のカスパーゼを標的にすることが目標である場合、関連する家族を特異的に標的とすることが重要です。組織内のカスパーゼレベルを検出する従来の技術には、ウェスタンブロッティング、酵素および蛍光測定アプローチが含まれます3,6。ただし、これらの測定値ではカスパーゼレベルの細胞特異的検出はできず、一部のシナリオでは、切断されたカスパーゼは従来のタンパク質分析測定では検出できないことがよくあります。カスパーゼは同じ組織内で異なるアポトーシスと非アポトーシスの役割を果たすことが知られている7ため、発生経路と疾患経路を正確に理解するには、細胞特異的なカスパーゼレベルの慎重な特性評価が必要です。
この研究は、神経血管低酸素虚血-網膜静脈閉塞(RVO)のモデルにおけるカスパーゼの活性化と機能を示しています7,8。網膜などの複雑な組織では、グリア細胞、ニューロン、血管系など、RVOで誘導される低酸素虚血の影響を受ける可能性のある複数の細胞型があります7。成体マウス網膜では、免疫組織化学(IHC)7によって測定されるように、健康な組織に明らかなカスパーゼの発現はほとんどありませんが、発生中9または網膜疾患のモデルではそうではありません10,11。IHCは、生物医学研究で確立された技術であり、疾患および病理学的標的の検証、空間的局在化による新しい役割の特定、およびタンパク質の定量を可能にしました。切断されたカスパーゼ産物がウェスタンブロットまたは蛍光分析によって検出できない場合、または明確なカスパーゼの特定の細胞位置または局在化によるカスパーゼシグナル伝達経路の調査では、IHCを使用する必要があります。
RVOに機能的に関連するカスパーゼを決定するために、IHCをカスパーゼおよび細胞マーカーの検証済み抗体とともに使用しました。研究室で実施された以前の研究では、カスパーゼ-9が虚血性脳卒中のモデルで急速に活性化され、神経機能障害と死から保護された高度に特異的な阻害剤によるカスパーゼ-9の阻害が示されました12。網膜は中枢神経系(CNS)の一部であるため、神経血管損傷におけるカスパーゼ-9の役割を照会し、さらに調査するためのモデルシステムとして機能します13。この目的のために、RVOのマウスモデルを使用して、カスパーゼ-9の細胞特異的な位置と分布、および神経血管損傷におけるその意味を研究しました。RVOは、血管損傷に起因する働く高齢者の失明の一般的な原因です14。カスパーゼ-9は内皮細胞では非アポトーシス的に発現するが、ニューロンでは発現しないことがわかった。
組織として、網膜は、血管網の鑑賞を可能にするフラットマウント、またはニューロン網膜層を強調する断面として視覚化されるという利点があります。断面におけるカスパーゼタンパク質発現の定量化は、網膜におけるカスパーゼの局在を特定することにより、網膜ニューロンの接続性と視覚機能においてどのカスパーゼが潜在的に重要であるかに関するコンテキストを提供します。同定および検証の後、目的のカスパーゼのターゲティングは、同定されたカスパーゼの誘導性細胞特異的欠失を用いて達成される。潜在的な治療上の問い合わせのために、関心のあるカスパーゼの関連性を、活性化されたカスパーゼを阻害するための特定のツールを使用してテストしました。カスパーゼ-9細胞パーサルインした高選択的阻害剤7,15については、Pen1-XBIR3を用いた。本報告では、生後2ヶ月の雄C57BL/6J株およびタモキシフェン誘導性内皮カスパーゼ-9ノックアウト(iEC Casp9KO)株を使用し、C57BL/6Jをバックグラウンドとした。これらの動物をRVOのマウスモデルに曝露し、C57BL/6Jをカスパーゼ-9選択的阻害剤Pen1-XBir3で治療した。記載された方法論は、中枢系および末梢系における疾患の他のモデルに適用することができる7、15。
Protocol
Representative Results
Discussion
カスパーゼは、細胞死と炎症における役割について最もよく研究されているプロテアーゼの多員ファミリーです。しかし、最近では、一部の家族についてさまざまな非死亡機能が発見されています4,5。カスパーゼ機能に関する私たちの理解の多くは、細胞培養の研究とヒトの病気からの推論データに由来しています。疾患においてカスパーゼの異?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラム(NSF-GRFP)助成金DGE-1644869および国立衛生研究所(NIH)の国立神経障害および脳卒中研究所(NINDS)、賞番号F99NS124180 NIH NINDSダイバーシティスペシャライズドF99(CKCOへ)、国立眼科研究所(NEI)5T32EY013933(AMPへ)、国立神経障害および脳卒中研究所(RO1 NS081333、 R03 NS099920からCMT)、および国防総省の陸軍/空軍(DURIPからCMT)。
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
