כימות של Caspase-9 מוכתם חיסונית ברקמת הרשתית

הקספאזות הן משפחה של פרוטאזות המווסתות מוות התפתחותי של תאים, תגובות חיסוניות ומוות תאי סוטה במחלה ^1,2. אמנם ידוע כי בני משפחת הקספאזה מושרים במגוון מחלות נוירודגנרטיביות, אך ההבנה איזה קספאז מניע פתולוגיה של מחלות מאתגרת יותר³. מחקרים כאלה דורשים כלים כדי לזהות, לאפיין ולאמת את תפקודם של בני משפחה קספאזיים בודדים. ניתוח הקספאזות האינדיבידואליות הרלוונטיות חשוב הן מבחינה מכניסטית והן מבחינה טיפולית, שכן בספרות יש מחקרים רבים המספקים עדות לתפקידים המגוונים של caspases ^4,5. לכן, אם המטרה היא למקד קספאז במחלה לתועלת טיפולית, זה קריטי שיהיה מיקוד ספציפי של בני המשפחה הרלוונטיים. טכניקות מסורתיות לזיהוי רמות קספאז ברקמה כוללות כתם מערבי וגישות אנזימטיות ופלואורומטריות ^3,6. עם זאת, אף אחד מהאמצעים הללו אינו מאפשר זיהוי ספציפי לתאים של רמות קספאזה, ובתרחישים מסוימים, לעתים קרובות לא ניתן לזהות קספאזות מבוקעות על ידי אמצעי ניתוח חלבונים מסורתיים. ידוע כי קספאזות יכולות למלא תפקידים אפופטוטיים ולא אפופטוטיים שונים באותה רקמה⁷, ולכן יש צורך באפיון זהיר של רמות הקספאז הספציפיות לתאים להבנה מדויקת של מסלולי התפתחות ומחלות.

מחקר זה מראה הפעלה ותפקוד של קספאז במודל של היפוקסיה-איסכמיה נוירו-וסקולרית – חסימת ורידים ברשתית (RVO)^7,8. ברקמה מורכבת כמו הרשתית, ישנם מספר סוגי תאים שיכולים להיות מושפעים מההיפוקסיה-איסכמיה המושרה ב-RVO, כולל תאי גלייה, נוירונים וכלי דם⁷. ברשתית העכבר הבוגרת, יש מעט מאוד ביטוי של קספאזות הניכר ברקמה בריאה, כפי שנמדד על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC)⁷, אך זה לא המקרה במהלך התפתחות⁹ או במודלים של מחלת רשתית^10,11. IHC היא טכניקה המבוססת היטב במחקר ביו-רפואי ואפשרה אימות של מחלות ומטרות פתולוגיות, זיהוי תפקידים חדשים באמצעות לוקליזציה מרחבית וכימות של חלבונים. במקרים בהם לא ניתן לזהות תוצרי קספאז שסועים על ידי כתם מערבי או ניתוח פלואורומטרי, וגם לא את מיקום התא הספציפי של קספאזות נפרדות או חקירה של מסלולי איתות קספאז באמצעות לוקליזציה, יש להשתמש ב- IHC.

על מנת לקבוע את הקספאזות הרלוונטיות מבחינה תפקודית ב-RVO, IHC שימש עם נוגדנים מאומתים עבור קספאזות וסמנים תאיים. המחקרים הקודמים שבוצעו במעבדה הראו כי caspase-9 הופעל במהירות במודל של שבץ איסכמי ועיכוב של caspase-9 עם מעכב ספציפי מאוד מוגן מפני תפקוד לקוי של נוירונים ומוות¹². מכיוון שהרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית (CNS), היא משמשת כמערכת מודל לחקירה וחקירה נוספת של תפקידו של קספאז-9 בפציעות נוירו-וסקולריות¹³. לשם כך, נעשה שימוש במודל העכבר של RVO כדי לחקור את המיקום וההתפלגות הספציפיים לתא של caspase-9 ואת משמעותו בפגיעה נוירו-וסקולרית. RVO הוא גורם נפוץ לעיוורון בקרב מבוגרים עובדים הנובע מפגיעה בכלי הדם¹⁴. נמצא כי קספאז-9 התבטא באופן לא אפופטוטי בתאי אנדותל, אך לא בתאי עצב.

כרקמה, הרשתית יש את היתרון של להיות חזותית כמו שטוח, אשר מאפשר הערכה של רשתות כלי הדם, או כמו חתכים, אשר מדגיש את שכבות הרשתית העצבית. כימות ביטוי חלבון הקספאזה בחתכים מספק הקשר, לגביו קספאז עשוי להיות קריטי בקישוריות העצבית ברשתית ובתפקוד הראייה על ידי זיהוי לוקליזציה של הקספאזה ברשתית. לאחר זיהוי ואימות, מיקוד של caspase של עניין מושגת באמצעות מחיקה ספציפית לתא inducible של caspase מזוהה. עבור פניות טיפוליות פוטנציאליות, הרלוונטיות של הקספאזות המעניינות נבדקה באמצעות כלים ספציפיים כדי לעכב את הקספאזה המופעלת. עבור caspase-9 תא היה מעכב סלקטיבי מאוד ^7,15, Pen1-XBIR3 שימש. לצורך דו”ח זה, נעשה שימוש בזן C57BL/6J זכרי בן חודשיים ובזן נוקאאוט אנדותל קספאז-9 הניתן לטמוקסיפן (iEC Casp9KO) עם רקע C57BL/6J. בעלי חיים אלה נחשפו למודל העכבר של RVO ו-C57BL/6J טופלו במעכב הסלקטיבי קספאז-9, Pen1-XBir3. ניתן ליישם את המתודולוגיה המתוארת על מודלים אחרים של מחלות במערכות המרכזיות וההיקפיות ^7,15.