Retina Dokusunda İmmün Boyalı Kaspaz-9'un Miktarının Belirlenmesi
Summary
Burada, kompleks dokulardaki fonksiyonel olarak ilgili kaspazları tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için ayrıntılı bir immünohistokimya protokolü sunulmaktadır.
Abstract
Kaspaz ailesinin, hücre farklılaşması, aksonal yol bulma ve proliferasyon dahil olmak üzere hücre ölümünün ötesinde birçok hücresel yola aracılık ettiği bilinmektedir. Hücre ölümü proteazları ailesinin tanımlanmasından bu yana, gelişim, sağlık ve hastalık durumlarında belirli aile üyelerinin işlevini tanımlamak ve genişletmek için araçlar araştırılmıştır. Bununla birlikte, şu anda yaygın olarak kullanılan ticari olarak temin edilebilen kaspaz araçlarının çoğu, hedeflenen kaspaz için spesifik değildir. Bu yazıda, sinir sistemindeki kaspaz-9’u tanımlamak, doğrulamak ve hedeflemek için kullandığımız yaklaşımı, immünohistokimyasal okumalarla yeni bir inhibitör ve genetik yaklaşımlar kullanarak tanımladık. Spesifik olarak, retinal nöronal dokuyu kaspazların varlığını ve işlevini tanımlamak ve doğrulamak için bir model olarak kullandık. Bu yaklaşım, hücre tipine özgü apoptotik ve apoptotik olmayan kaspaz-9 fonksiyonlarının sorgulanmasını sağlar ve ilgilenilen diğer karmaşık dokulara ve kaspazlara uygulanabilir. Kaspazların fonksiyonlarını anlamak, hücre biyolojisindeki mevcut bilgilerin genişletilmesine yardımcı olabilir ve ayrıca hastalığa katılımları nedeniyle potansiyel terapötik hedefleri tanımlamak için avantajlı olabilir.
Introduction
Kaspazlar, hastalık 1,2’de gelişimsel hücre ölümünü, immün yanıtları ve anormal hücre ölümünü düzenleyen bir proteaz ailesidir. Kaspaz ailesinin üyelerinin çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda indüklendiği iyi bilinmekle birlikte, hangi kaspazın hastalık patolojisini yönlendirdiğini anlamak daha zordur3. Bu tür çalışmalar, bireysel kaspaz ailesi üyelerinin işlevini tanımlamak, karakterize etmek ve doğrulamak için araçlar gerektirir. İlgili bireysel kaspazların ayrıştırılması hem mekanik hem de terapötik açıdan önemlidir, çünkü literatürde kaspazların farklı rollerine dair kanıtlar sağlayan çok sayıda çalışma vardır 4,5. Bu nedenle, amaç terapötik bir fayda için bir hastalıkta bir kaspazı hedeflemekse, ilgili aile üyelerinin spesifik olarak hedeflenmesi kritik öneme sahiptir. Dokudaki kaspaz düzeylerini saptamak için kullanılan geleneksel teknikler arasında batı lekelenmesi ve enzimatik ve florometrik yaklaşımlaryer almaktadır 3,6. Bununla birlikte, bu önlemlerin hiçbiri kaspaz seviyelerinin hücreye özgü tespitine izin vermez ve bazı senaryolarda, parçalanmış kaspazlar genellikle geleneksel protein analizi önlemleri ile tespit edilemez. Kaspazların aynı dokuda farklı apoptotik ve apoptotik olmayan roller oynayabileceği bilinmektedir7, bu nedenle gelişimsel ve hastalık yolaklarının doğru anlaşılması için hücreye özgü kaspaz düzeylerinin dikkatli bir şekilde karakterize edilmesi gerekmektedir.
Bu çalışmada nörovasküler hipoksi-iskemi – retinal ven tıkanıklığı (RVO)7,8 modelinde kaspaz aktivasyonu ve fonksiyonu gösterilmiştir. Retina gibi karmaşık bir dokuda, glial hücreler, nöronlar ve vaskülatür7 dahil olmak üzere RVO’da indüklenen hipoksi-iskemiden etkilenebilecek birden fazla hücre tipi vardır. Yetişkin fare retinasında, immünohistokimya (IHC)7 ile ölçüldüğü gibi, sağlıklı dokuda belirgin olan çok az kaspaz ekspresyonu vardır, ancak gelişim9 sırasında veya retina hastalığı10,11 modellerinde durum böyle değildir. IHC, biyomedikal araştırmalarda iyi kurulmuş ve hastalık ve patolojik hedeflerin doğrulanmasına, mekansal lokalizasyon yoluyla yeni rollerin tanımlanmasına ve proteinlerin nicelleştirilmesine izin veren bir tekniktir. Parçalanmış kaspaz ürünlerinin batı lekesi veya florometrik analiz ile tespit edilemediği durumlarda, farklı kaspazların spesifik hücre lokalizasyonu veya lokalizasyon yoluyla kaspaz sinyal yollarının sorgulanması durumunda, IHC kullanılmalıdır.
RVO’da fonksiyonel olarak ilişkili kaspaz (lar) ı belirlemek için, IHC, kaspazlar ve hücresel belirteçler için doğrulanmış antikorlarla birlikte kullanıldı. Laboratuvarda yapılan önceki çalışmalar, kaspaz-9’un bir iskemik inme modelinde ve nöronal disfonksiyon ve ölümden korunan oldukça spesifik bir inhibitör ile kaspaz-9’un inhibisyonunda hızla aktive olduğunu göstermiştir12. Retina, merkezi sinir sisteminin (CNS) bir parçası olduğundan, nörovasküler yaralanmalarda kaspaz-9’un rolünü sorgulamak ve daha fazla araştırmak için bir model sistem olarak hizmet eder13. Bu amaçla, RVO’nun fare modeli, kaspaz-9’un hücreye özgü yerini ve dağılımını ve nörovasküler hasardaki etkisini incelemek için kullanıldı. RVO, çalışan yaşlı erişkinlerde vasküler yaralanmadan kaynaklanan körlüğün yaygın bir nedenidir14. Kaspaz-9’un endotel hücrelerinde apoptotik olmayan bir şekilde eksprese edildiği, ancak nöronlarda eksprese edilmediği bulundu.
Bir doku olarak, retina, vasküler ağların takdir edilmesini sağlayan düz bir montaj veya nöronal retinal tabakaları vurgulayan kesitler olarak görselleştirilme avantajına sahiptir. Enine kesitlerde kaspaz proteini ekspresyonunun nicelleştirilmesi, retinadaki kaspaz (lar) ın lokalizasyonunu tanımlayarak retinal nöronal bağlantı ve görme fonksiyonunda hangi kaspazın potansiyel olarak kritik olduğu konusunda bağlam sağlar. Tanımlama ve validasyondan sonra, tanımlanan kaspazın indüklenebilir hücreye özgü delesyonu kullanılarak ilgilenilen kaspazın hedeflenmesi sağlanır. Potansiyel terapötik sorular için, aktif kaspazı inhibe etmek için özel araçlar kullanılarak ilgilenilen kaspazların alaka düzeyi test edildi. Kaspaz-9 için yüksek seçici inhibitör 7,15 pervane edilen bir hücre, Pen1-XBIR3 kullanıldı. Bu yazıda 2 aylık erkek C57BL/6J suşu ve C57BL/6J arka planlı tamoksifen kaynaklı endotelyal kaspaz-9 nakavt (iEC Casp9KO) suşu kullanıldı. Bu hayvanlar RVO’nun fare modeline maruz bırakıldı ve C57BL / 6J, kaspaz-9 seçici inhibitörü Pen1-XBir3 ile tedavi edildi. Tanımlanan metodoloji, merkezi ve periferik sistemlerdeki diğer hastalık modellerine uygulanabilir 7,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kaspazlar, hücre ölümü ve inflamasyondaki rolleri için en iyi şekilde çalışılan çok üyeli bir proteaz ailesidir; Bununla birlikte, daha yakın zamanlarda, bazı aile üyeleri için çeşitli ölüm dışı işlevler ortaya çıkarılmıştır 4,5. Kaspaz fonksiyonu hakkındaki anlayışımızın çoğu, hücre kültüründeki çalışmalardan ve insan hastalığından elde edilen çıkarımsal verilerden kaynaklanmaktadır. Hastalıkta kaspazların an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı (NSF-GRFP) hibe DGE – 1644869 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS), ödül numarası F99NS124180 NIH NINDS Çeşitlilik İhtisas F99 (CKCO’ya), Ulusal Göz Enstitüsü (NEI) 5T32EY013933 (AMP’ye), Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (RO1 NS081333, R03 NS099920’den CMT’ye) ve Savunma Bakanlığı Ordu/Hava Kuvvetleri (DURIP’ten CMT’ye).
Materials
| anti-Caspase-7 488 | Novus Biologicals | NB-56529AF488 | use at 1:150 |
| anti-cl-Caspase-9 | Cell Signaling | 9505-S | use at 1:800 |
| anti-CD31 | BD Pharmingen | 553370 | use at 1:50 |
| Confocal Spinning Disc Microscope | Biovision | ||
| FIJI 2.3.0 | open source | ||
| Fluormount G | Fisher | 50-187-88 | |
| Forcep | Roboz | RS-5015 | |
| iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Isolectin (594, 649) | Vector | DL-1207 | use at 1:200 |
| Ketamine Hydrochloride | Henry Schein | NDC: 11695-0702-1 | |
| Perfusion pump | Masterflex | ||
| Pen1-XBir3 | lab generated | see Avrutsky 2020 | |
| Prism 9.1 | GraphPad | ||
| Tissue-Tek O.C.T. | Fisher | 14-373-65 | |
| Vis-a-View 4.0 | Visitron Systems | ||
| Xylazine | Akorn | NDCL 59399-110-20 |
References
- Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
- Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, 79-85 (2018).
- Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
- Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728 (2021).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
- Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
- Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173 (2020).
- Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980 (2021).
- Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
- Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137 (2015).
- Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
- Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427 (2019).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
- Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
- Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).
