Количественная оценка иммуноокрашенной каспазы-9 в ткани сетчатки

Каспазы представляют собой семейство протеаз, которые регулируют гибель клеток развития, иммунные реакции и аберрантную гибель клеток при заболевании ^1,2. Хотя хорошо известно, что члены семейства каспазы индуцируются при различных нейродегенеративных заболеваниях, понимание того, какая каспаза приводит к патологии заболевания, является более сложным³. Такие исследования требуют инструментов для выявления, характеристики и подтверждения функции отдельных членов семейства каспазы. Анализ соответствующих отдельных каспаз важен как с механистической, так и с терапевтической точки зрения, поскольку в литературе есть многочисленные исследования, свидетельствующие о различных ролях каспаз ^4,5. Таким образом, если цель состоит в том, чтобы нацелиться на каспазу при заболевании для терапевтической пользы, крайне важно иметь конкретное нацеливание на соответствующего члена (членов) семьи. Традиционные методы определения уровней каспазы в тканях включают вестерн-блоттинг и ферментативный и флуорометрический подходы ^3,6. Однако ни одна из этих мер не позволяет определить специфические для клеток уровни каспазы, и в некоторых сценариях расщепленные каспазы часто не могут быть обнаружены традиционными мерами анализа белка. Известно, что каспазы могут играть различные апоптотические и неапоптотические роли в одной и той же ткани⁷, поэтому для точного понимания путей развития и заболевания необходима тщательная характеристика клеточных специфических уровней каспазы.

Данное исследование показывает активацию и функцию каспазы в модели нейрососудистой гипоксии-ишемии – окклюзии вен сетчатки (RVO)^7,8. В сложной ткани, такой как сетчатка, существует несколько типов клеток, которые могут быть затронуты гипоксией-ишемией, индуцированной в RVO, включая глиальные клетки, нейроны и сосудистую систему⁷. У взрослой мышиной сетчатки очень мало выраженности каспаз, проявляющихся в здоровой ткани, что измерено иммуногистохимией (IHC)⁷, но это не так во время развития⁹ или в моделях заболевания сетчатки^10,11. IHC – это метод, который хорошо зарекомендовал себя в биомедицинских исследованиях и позволил валидировать заболевания и патологические цели, идентифицировать новые роли посредством пространственной локализации и количественной оценки белков. В тех случаях, когда расщепленные продукты каспазы не могут быть обнаружены с помощью вестерн-блоттинга или флуорометрического анализа, а также конкретного расположения клеток отдельных каспаз или опроса сигнальных путей каспазы через локализацию, следует использовать IHC.

Чтобы определить каспазу (каспазу), функционально значимую в RVO, IHC использовали с валидированными антителами к каспазам и клеточным маркерам. Предыдущие исследования, проведенные в лаборатории, показали, что каспаза-9 быстро активировалась в модели ишемического инсульта и ингибирования каспазы-9 высокоспецифичным ингибитором, защищенным от нейрональной дисфункции и смерти¹². Поскольку сетчатка является частью центральной нервной системы (ЦНС), она служит модельной системой для запроса и дальнейшего изучения роли каспазы-9 в нейрососудистых повреждениях¹³. С этой целью мышиная модель RVO была использована для изучения клеточного специфического местоположения и распределения каспазы-9 и ее влияния на нейрососудистое повреждение. RVO является распространенной причиной слепоты у людей трудоспособного возраста, которая является результатом повреждения сосудов¹⁴. Было установлено, что каспаза-9 экспрессировалась неапоптотическим способом в эндотелиальных клетках, но не в нейронах.

Как ткань, сетчатка имеет преимущество в том, что она визуализируется либо как плоская гора, что позволяет оценить сосудистые сети, либо как поперечные сечения, которые выделяют нейронные слои сетчатки. Количественная оценка экспрессии белка каспазы в поперечных сечениях обеспечивает контекст, в отношении которого каспаза потенциально имеет решающее значение для нейронной связности сетчатки и функции зрения путем идентификации локализации каспазы (каспазы) в сетчатке. После идентификации и валидации нацеливание на интересующую каспазу достигается с использованием индуцируемой клеточной специфической делеции идентифицированной каспазы. Для потенциальных терапевтических исследований актуальность интересующих каспаз была проверена с использованием специальных инструментов для ингибирования активированной каспазы. Для каспазы-9 использовался клеточный проникающий высокоселективный ингибитор ^7,15, Pen1-XBIR3. Для этого отчета были использованы 2-месячный мужской штамм C57BL/6J и тамоксифен-индуцируемый эндотелиальная каспаза-9 нокаут (iEC Casp9KO) с фоном C57BL/6J. Эти животные подвергались воздействию мышиной модели RVO, а C57BL/6J обрабатывали селективным ингибитором каспазы-9 Pen1-XBir3. Описанная методика может быть применена к другим моделям заболевания в центральной и периферической системах ^7,15.