In vitro Digestione delle emulsioni in una singola goccia tramite scambio multifase di fluidi gastrointestinali simulati

Capire come viene digerito il grasso, che comporta la digestione dell’emulsione, è importante per progettare razionalmente prodotti con funzionalità su misura¹. Il substrato per la digestione dei grassi è un’emulsione poiché il grasso viene emulsionato al consumo per azione meccanica e miscelazione con biotensioattivi nella bocca e nello stomaco. Inoltre, la maggior parte del grasso consumato dagli esseri umani è già emulsionato (come i prodotti lattiero-caseari), e nel caso di neonati o di alcuni anziani, questa è l’unica forma di consumo. Quindi, la progettazione di prodotti a base di emulsioni con profili digestivi specifici è molto importante nella nutrizione¹. Inoltre, le emulsioni possono incapsulare e fornire nutrienti, farmaci o bioattivi lipofili² per affrontare diverse condizioni gastrointestinali come obesità³, fortificazione dei nutrienti, allergie alimentari e malattie digestive. Nelle emulsioni olio-in-acqua, le goccioline lipidiche sono circondate da strati interfacciali di emulsionanti come proteine, tensioattivi, polimeri, particelle e miscele⁴. Il ruolo degli emulsionanti è duplice: stabilizzare l’emulsione⁵ e proteggere/trasportare il composto incapsulato in un sito specifico. Il raggiungimento di una digeribilità su misura delle emulsioni dipende dalla loro composizione iniziale, ma richiede anche il monitoraggio della continua evoluzione di questa interfaccia durante il transito attraverso il tratto gastrointestinale (Figura 1).

Figura 1: Applicazione dell’ingegneria interfacciale delle emulsioni per affrontare alcune delle principali condizioni gastrointestinali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La digestione lipidica è in definitiva un processo interfacciale perché richiede l’adsorbimento di lipasi (gastriche o pancreatiche) sull’interfaccia olio-acqua delle goccioline lipidiche emulsionate attraverso lo strato interfacciale per raggiungere e idrolizzare i trigliceridi contenuti nell’olio in acidi grassi liberi e monoacilgliceridi⁶. Questo è schematizzato nella Figura 2. La lipasi gastrica compete con la pepsina e i fosfolipidi nello stomaco per l’interfaccia olio-acqua (Figura 2, digestione gastrica). Quindi, la lipasi / colipasi pancreatica compete con tripsina / chimotripsina, fosfolipidi, sali biliari e prodotti digestivi nell’intestino tenue. Le proteasi possono alterare la copertura interfacciale, impedendo o favorendo l’adsorbimento della lipasi, mentre i sali biliari sono altamente attivi in superficie e spostano la maggior parte dell’emulsionante rimanente per promuovere l’adsorbimento della lipasi (Figura 2, digestione intestinale). Alla fine, la velocità e l’estensione della lipolisi dipendono dalle proprietà interfacciali dell’emulsione digerita iniziale / gastrica, come lo spessore, le connessioni inter / intramolecolari e le interazioni elettrostatiche e steriche. Di conseguenza, il monitoraggio dell’evoluzione dello strato interfacciale mentre viene digerito offre una piattaforma sperimentale per identificare i meccanismi interfacciali e gli eventi che influenzano l’adsorbimento della lipasi e, quindi, la digestione dei lipidi.

Figura 2: Diagramma schematico che illustra il ruolo delle interfacce nella digestione dei lipidi gastrointestinali. L’idrolisi della pepsina altera la composizione interfacciale nella fase gastrica, mentre la lipasi gastrica idrolizza i trigliceridi. Nell’intestino tenue, tripsina/chimotripsina idrolizzano ulteriormente il film interfacciale, mentre la lipolisi procede per adsorbimento di BS/lipasi, idrolisi dei trigliceridi e desorbimento dei prodotti lipolitici mediante solubilizzazione nelle micelle/complesso BS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

L’apparecchiatura a goccia pendente dell’Università di Granada (UGR) è implementata con una tecnologia brevettata, il doppio capillare coassiale, che consente lo scambio di sottofasi della soluzione sfusa⁷. Il capillare, che trattiene la goccia pendente, è costituito da una disposizione di due capillari coassiali collegati in modo indipendente a ciascun canale di un doppio microiniettore. Ogni microiniettore può operare in modo indipendente, consentendo lo scambio del contenuto caduto tramite flusso passante⁷. Di conseguenza, lo scambio di sottofase consiste nell’iniezione simultanea della nuova soluzione con il capillare interno e nell’estrazione della soluzione sfusa con il capillare esterno utilizzando la stessa portata. Questo processo consente la sostituzione della soluzione sfusa senza disturbi dell’area interfacciale o del volume della goccia. Questa procedura è stata successivamente aggiornata a uno scambio multi-sottofase, che consente fino a otto scambi sequenziali di sottofase della soluzione di massa di goccioline⁸. Ciò consente la simulazione del processo digestivo in una singola goccia acquosa sospesa in mezzi lipidici scambiando sequenzialmente la soluzione bulk con mezzi artificiali che imitano i diversi compartimenti (bocca, stomaco, intestino tenue). L’intera configurazione è rappresentata nella Figura 3, inclusi i dettagli dei componenti. Le siringhe nel microiniettore sono collegate alle otto valvole vias, ciascuna collegata a un tubo di microcentrifuga contenente il fluido digestivo artificiale con i componenti descritti nella Figura 2.

Figura 3: Vista generale di OCTOPUS con tutti i componenti. La telecamera CCD, il microscopio, il microposizionatore, la cella termostabilizzata e il doppio capillare collegati indipendentemente a un doppio microiniettore con due siringhe collegate a otto valvole vias. Ogni siringa si collega con capillare, quattro provette di microcentrifuga con campione e uno scarico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La figura 4A mostra come ciascuno dei fluidi digestivi artificiali viene iniettato nella goccia pendente mediante scambio di sottofase attraverso il doppio capillare. Ogni composto digestivo descritto in Figura 2 può essere applicato simultaneamente / sequenzialmente, simulando il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale. I fluidi digestivi artificiali contengono diversi enzimi e biotensioattivi, che alterano la tensione interfacciale dell’emulsionante iniziale, come schematizzato nella Figura 4B. Il software DINATEN (vedi Table of Materials), anch’esso sviluppato presso l’UGR, registra l’evoluzione della tensione interfacciale in tempo reale man mano che lo strato interfacciale iniziale viene digerito in vitro. Inoltre, dopo ogni fase digestiva, l’elasticità dilatatoria dello strato interfacciale viene calcolata imponendo oscillazioni periodiche di volume / area interfacciale sullo strato interfacciale stabilizzato e registrando la risposta della tensione interfacciale. Il periodo/frequenza e l’ampiezza dell’oscillazione possono essere variati, e l’elaborazione delle immagini con il software CONTACTO fornisce i parametri reologici dilatatori⁸.

Figura 4: Esempi di profili di digestione . (A) Lo strato emulsionante iniziale è sottoposto a mezzi digestivi artificiali posti nella microcentrifuga mediante scambio sequenziale di sottofasi delle diverse soluzioni nella goccia pendente. (B) L’evoluzione generale della tensione interfacciale (asse y) dell’emulsionante iniziale in funzione del tempo (asse x) in quanto viene digerito in vitro dai vari enzimi/biotensioattivi nei mezzi artificiali. Uno scambio finale di sottofase con fluido intestinale semplice misura il desorbimento del lipide digerito mediante solubilizzazione in micelle miste. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Questo studio presenta il protocollo generale progettato per misurare la digestione in vitro degli strati interfacciali con apparecchiature pendenti per la caduta⁹. Lo strato interfacciale iniziale è soggetto in sequenza a condizioni che imitano il passaggio attraverso il tratto gastrointestinale, come illustrato nella Figura 2. Questi diversi mezzi digestivi vengono iniettati nella goccia del pendente mediante scambio di sottofase delle diverse soluzioni contenute nelle provette della microcentrifuga (Figura 4A). La composizione di questi mezzi può essere personalizzata in base alle condizioni gastrointestinali che verranno valutate, ovvero proteolisi/lipolisi gastrica/intestinale, consentendo di misurare gli effetti cumulativi e le sinergie¹⁰. Le condizioni sperimentali utilizzate per imitare il processo di digestione in ciascun compartimento seguono il protocollo di consenso internazionale pubblicato da INFOGEST che dettaglia il pH e le quantità di elettroliti ed enzimi¹¹. Il dispositivo sperimentale basato sulla goccia del pendente consente di registrare la tensione interfacciale in situ durante tutto il processo di digestione simulato. La reologia dilativa dello strato interfacciale viene calcolata alla fine di ogni fase digestiva. In questo modo, ogni emulsionante offre un profilo di digestione che illustra le proprietà delle interfacce digerite, come illustrato nella Figura 4B. Ciò consente l’estrazione di conclusioni riguardanti la sua suscettibilità o resistenza alle diverse fasi del processo digestivo. In generale, i mezzi digestivi artificiali contengono pH acido/basico, elettroliti, proteasi (gastrica e intestinale), lipasi (gastrica e intestinale), sali biliari e fosfolipidi, che vengono disciolti nei rispettivi fluidi digestivi (gastrico o intestinale). La figura 4B mostra un profilo generico dell’evoluzione della tensione interfacciale di un emulsionante, prima sottoposta all’azione della proteasi, seguita dalle lipasi. In generale, la proteolisi dello strato interfacciale favorisce un aumento della tensione interfacciale dovuta al desorbimento dei peptidi idrolizzati^9,12, mentre la lipolisi determina una riduzione molto marcata della tensione interfacciale dovuta all’adsorbimento di sali biliari e lipasi ¹³. Uno scambio finale di sottofase con il fluido intestinale esaurisce la soluzione sfusa di materiale non adsorbito / digerito e promuove il desorbimento dei composti solubili e la solubilizzazione dei lipidi digeriti nelle micelle miste. Questo è quantificato dall’aumento della tensione interfacciale registrata (Figura 4B).

In sintesi, il disegno sperimentale implementato nella goccia pendente per simulare la digestione in vitro in una singola goccia consente di misurare gli effetti cumulativi e le sinergie mentre il processo di digestione viene applicato sequenzialmente allo strato interfacciale iniziale¹⁰. La composizione di ciascun mezzo digestivo può essere facilmente sintonizzata per tenere conto delle particolarità delle condizioni digestive, comprese le patologie gastrointestinali o i mezzi digestivi infantili¹⁴. Quindi, l’identificazione dei meccanismi interfacciali che influenzano la proteolisi e la lipolisi può essere utilizzata per modulare la digestione mediante l’ingegneria interfacciale delle emulsioni. I risultati ottenuti possono essere applicati nella progettazione di nuove matrici alimentari con funzionalità su misura come bassa allergenicità, apporto energetico controllato e ridotta digeribilità 15,16,17,18,19.