במבחנה עיכול תחליבים בטיפה אחת באמצעות החלפה רב-פאזית של נוזלי מערכת העיכול המדומים

הבנת אופן העיכול של שומן, הכוללת עיכול תחליבים, חשובה לתכנון רציונלי של מוצרים עם פונקציונליות מותאמת אישית¹. המצע לעיכול שומן הוא תחליב שכן השומן מתחלב עם הצריכה על ידי פעולה מכנית וערבוב עם חומרים פעילי שטח ביולוגיים בפה ובקיבה. כמו כן, רוב השומן הנצרך על ידי בני אדם כבר מתחלב (כגון מוצרי חלב), ובמקרה של תינוקות או כמה קשישים, זוהי צורת הצריכה היחידה. לפיכך, העיצוב של מוצרים מבוססי תחליב עם פרופילי עיכול ספציפיים חשוב מאוד בתזונה¹. יתר על כן, תחליבים יכולים לעטוף ולספק חומרים מזינים, תרופות או פעילות ביולוגית ליפופילית² כדי להתמודד עם מצבים שונים במערכת העיכול כגון השמנת יתר³, חיזוק חומרים מזינים, אלרגיות למזון ומחלות עיכול. בתחליבי שמן במים, טיפות השומנים מוקפות בשכבות בין-פאזיות של מתחלבים כגון חלבונים, חומרים פעילי שטח, פולימרים, חלקיקים ותערובות⁴. תפקידם של מתחלבים הוא כפול: לייצב את האמולסיה⁵ ולהגן/להעביר את התרכובת העטופה לאתר מסוים. השגת יכולת עיכול מותאמת אישית של אמולסיות תלויה בהרכב הראשוני שלהם, אך דורשת גם מעקב אחר האבולוציה המתמשכת של ממשק זה במהלך המעבר דרך מערכת העיכול (איור 1).

איור 1: יישום הנדסה בין-פאזית של תחליבים כדי להתמודד עם כמה מהמצבים העיקריים במערכת העיכול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

עיכול שומנים הוא בסופו של דבר תהליך בין-פאזי מכיוון שהוא דורש ספיחה של ליפאזות (קיבה או לבלב) על ממשק מי השמן של טיפות שומנים מתחלבות דרך השכבה הבין-פאזית כדי להגיע ולהידרוליזה של הטריגליצרידים הכלולים בשמן לחומצות שומן חופשיות ומונואצילגליצרידים⁶. זה מתואר באיור 2. ליפאז קיבה מתחרה עם פפסין ופוספוליפידים בקיבה על ממשק שמן-מים (איור 2, עיכול קיבה). לאחר מכן, ליפאז/קוליפאז בלבלב מתחרים בטריפסין/כימוטריפסין, פוספוליפידים, מלחי מרה ומוצרי עיכול במעי הדק. פרוטאזות יכולות לשנות את הכיסוי הבין-מרחבי, למנוע או להעדיף ספיחת ליפאז, בעוד שמלחי מרה פעילים מאוד על פני השטח ודוחקים את רוב המתחלב שנותר כדי לקדם ספיחת ליפאז (איור 2, עיכול מעיים). בסופו של דבר, הקצב וההיקף של ליפוליזה תלויים בתכונות הבין-פאזיות של התחליב המעוכל הראשוני/קיבה, כגון עובי, קשרים בין-מולקולריים ואינטראקציות אלקטרוסטטיות וסטריות. בהתאם לכך, מעקב אחר האבולוציה של השכבה הבין-פאזית בזמן שהיא מתעכלת מציע פלטפורמה ניסיונית לזיהוי מנגנונים ואירועים בין-פאזיים המשפיעים על ספיחת ליפאז, ומכאן על עיכול השומנים.

איור 2: דיאגרמה סכמטית הממחישה את תפקידם של ממשקים בעיכול שומנים במערכת העיכול. הידרוליזה של פפסין משנה את ההרכב הבין-פאזי בשלב הקיבה, בעוד שליפאז קיבה מבצע הידרוליזה של טריגליצרידים. במעי הדק, טריפסין/כימוטריפסין מבצעים הידרוליזה נוספת של הסרט הבין-מרחבי, בעוד שליפוליזה ממשיכה על ידי ספיחה של BS/ליפאזות, הידרוליזה של טריגליצרידים, וספיגה של מוצרים ליפוליטיים על ידי סולוביזציה במיקלות/קומפלקס BS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ציוד הטלת התליון באוניברסיטת גרנדה (UGR) מיושם בטכנולוגיה מוגנת בפטנט, הנימים הכפולים הקואקסיאליים, המאפשרת החלפה תת-פאזית של הפתרון בתפזורת⁷. הנימי, המחזיק את טיפת התליון, מורכב מסידור של שני נימים קואקסיאליים המחוברים באופן עצמאי לכל ערוץ של מיקרו-אינז’קטור כפול. כל מיקרו-אינז’קטור יכול לפעול באופן עצמאי, מה שמאפשר להחליף את התוכן שנשמט על ידי זרימה^{דרך 7}. לפיכך, חילופי subphase מורכב הזרקה בו זמנית של הפתרון החדש עם נימי הפנימי ואת מיצוי של תמיסה בתפזורת עם נימי החיצוני באמצעות אותו קצב זרימה. תהליך זה מאפשר החלפת התמיסה בתפזורת ללא הפרעה לאזור הבין-תאי או לנפח הטיפות. הליך זה שודרג מאוחר יותר להחלפה מרובת תת-פאזות, המאפשרת עד שמונה החלפות תת-פאזיות רצופות של פתרון תפזורת הטיפות⁸. זה מאפשר סימולציה של תהליך העיכול בטיפה מימית אחת המרחפת במדיה ליפידית על ידי החלפה רציפה של התמיסה בתפזורת עם מדיה מלאכותית המחקה את התאים השונים (פה, קיבה, מעי דק). המערך כולו מיוצג באיור 3, כולל פרטי הרכיבים. המזרקים במיקרו-אינז’קטור מחוברים לשמונת שסתומי ה-vias, שכל אחד מהם מתחבר לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את נוזל העיכול המלאכותי עם רכיבים המתוארים באיור 2.

איור 3: מבט כללי על התמנון עם כל הרכיבים. מצלמת ה-CCD, המיקרוסקופ, המיקרו-מייצב, התא התרמו-יציב והנימים הכפולים מחוברים באופן עצמאי למיקרו-מזרק כפול עם שני מזרקים המחוברים לשמונה שסתומי ויאס. כל מזרק מתחבר עם נימי, ארבעה צינורות microcentrifuge עם דגימה פריקה אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4A מראה כיצד כל אחד מנוזלי העיכול המלאכותיים מוזרק לתוך טיפת התליון על ידי חילוף תת-פאזי דרך הנימים הכפולים. כל תרכובת עיכול המפורטת באיור 2 ניתנת ליישום בו-זמנית/ברצף, תוך הדמיה של המעבר דרך מערכת העיכול. נוזלי העיכול המלאכותיים מכילים אנזימים שונים וחומרים פעילי שטח ביולוגיים, שמשנים את המתח הבין-תאי של המתחלב הראשוני, כפי שמתואר באיור 4B. התוכנה DINATEN (ראה טבלת חומרים), שפותחה גם היא ב- UGR, מתעדת את האבולוציה של המתח הבין-פאזי בזמן אמת כאשר השכבה הבין-פאזית הראשונית מתעכלת במבחנה. כמו כן, לאחר כל שלב עיכול, מחושבת האלסטיות הרחיבה של השכבה הבין-פאזית על ידי הטלת תנודות מחזוריות של נפח/אזור בין-פאזי על השכבה הבין-פאזית המיוצבת ורישום התגובה של המתח הבין-מרחבי. התקופה/תדר והמשרעת של התנודה יכולים להיות מגוונים, ועיבוד תמונה עם התוכנה CONTACTO מספק את הפרמטרים הריאולוגיים המרחיבים⁸.

איור 4: דוגמאות לפרופילי עיכול . (A) שכבת התחליב הראשונית נתונה למדיית עיכול מלאכותית הממוקמת במיקרוצנטריפוגה על ידי החלפת תת-פאזה רציפה של התמיסות השונות לתוך טיפת התליון. (B) האבולוציה הכללית של המתח הבין-פאזי (ציר y) של המתחלב הראשוני כפונקציה של הזמן (ציר x) כפי שהוא מתעכל במבחנה על ידי האנזימים/ביו-חומרים פעילי שטח שונים במדיה המלאכותית. חילוף תת-פאזי סופי עם נוזל מעיים רגיל מודד את הספיגה של שומנים מעוכלים על ידי סולוביזציה במיצלות מעורבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מחקר זה מציג את הפרוטוקול הכללי שנועד למדוד עיכול במבחנה של שכבות בין-מרחביות באמצעות ציוד לנפילת תליון⁹. השכבה הבין-פאזית הראשונית נתונה ברצף לתנאים המחקים את המעבר דרך מערכת העיכול, כפי שמתואר באיור 2. מדיות העיכול השונות האלה מוזרקות לתוך טיפת התליון על ידי החלפה תת-פאזית של התמיסות השונות הכלולות בצינורות המיקרוצנטריפוגה (איור 4A). ההרכב של מדיה זו יכול להיות מותאם אישית בהתאם לתנאי העיכול שיוערכו, כלומר, פרוטאוליזה קיבה / מעיים / ליפוליזה, המאפשר מדידת השפעות מצטברות ו sinergies¹⁰. תנאי הניסוי המשמשים לחיקוי תהליך העיכול בכל תא תואמים את פרוטוקול הקונצנזוס הבינלאומי שפורסם על ידי INFOGEST המפרט את ה- pH ואת כמויות האלקטרוליטים והאנזימים¹¹. המכשיר הניסיוני המבוסס על נפילת תליון מאפשר הקלטה של המתח הבין-פאזי באתרו לאורך כל תהליך העיכול המדומה. הריאולוגיה המתרחבת של השכבה הבין-פאזית מחושבת בסוף כל שלב עיכול. בדרך זו, כל מתחלב מציע פרופיל עיכול הממחיש את התכונות של הממשקים המעוכלים, כפי שמתואר באיור 4B. זה מאפשר מיצוי של מסקנות לגבי רגישות או התנגדות לשלבים שונים של תהליך העיכול. באופן כללי, מדיית העיכול המלאכותית מכילה חומצה/pH בסיסית, אלקטרוליטים, פרוטאזות (קיבה ומעי), ליפאזות (קיבה ומעי), מלחי מרה ופוספוליפידים, המומסים בנוזלי העיכול שלהם (קיבה או מעיים). איור 4B מראה פרופיל גנרי של האבולוציה של המתח הבין-פאזי של המתחלב, תחילה נתון לפעולת פרוטאזות, ולאחר מכן ליפאזות. באופן כללי, פרוטאוליזה של השכבה הבין-פאזית מקדמת עלייה במתח הבין-פאזלי עקב ספיגה של פפטידים שעברו הידרוליזה^9,12, בעוד שליפוליזה גורמת לירידה תלולה מאוד במתח הבין-פאזי עקב ספיחה של מלחי מרה וליפאזות ¹³. החלפה תת-פאזית סופית עם נוזל מעיים מדלדלת את התמיסה הגדולה של חומר לא מעוכל/מעוכל ומקדמת ספיגה של תרכובות מסיסות וסילוק שומנים מעוכלים במיקסים של מיצלות. ניתן לכמת זאת על-ידי העלייה במתח הבין-פאזי שנרשמה (איור 4B).

לסיכום, התכנון הניסיוני המיושם בטיפת התליון כדי לדמות עיכול במבחנה בטיפה בודדת מאפשר למדוד השפעות מצטברות וסינרגיות כאשר תהליך העיכול מוחל ברצף על שכבת הביניים^{הראשונית 10}. הרכב של כל מדיה העיכול ניתן לכוונן בקלות כדי להסביר את המאפיינים של תנאי העיכול, כולל פתולוגיות במערכת העיכול או מדיה העיכול התינוק¹⁴. לאחר מכן, ניתן להשתמש בזיהוי המנגנונים הבין-פאזיים המשפיעים על פרוטאוליזה וליפוליזה כדי לווסת את העיכול על ידי הנדסה בין-פאזית של תחליבים. ניתן ליישם את התוצאות המתקבלות בתכנון מטריצות מזון חדשניות עם פונקציות מותאמות אישית כגון אלרגניות נמוכה, צריכת אנרגיה מבוקרת וירידה בעיכול 15,16,17,18,19^.