Vi har tidligere utviklet protokoller for Caenorhabditis elegans for å danne kort- og langsiktige assosiative minner ved henholdsvis masse- og avstandstrening. Her beskrives detaljerte protokoller for kondisjonering av C. elegans ved å parre henholdsvis 1-propanol og saltsyre som betinget og ubetinget stimuli for å danne aversiv assosiativ hukommelse.
Nematoden Caenorhabditis elegans er en attraktiv modellorganisme for å studere læring og minne på molekylære og cellulære nivåer på grunn av enkelheten i nervesystemet, hvis kjemiske og elektriske koblingsskjemaer ble fullstendig rekonstruert fra serielle elektronmikrografer av tynne seksjoner. Her beskriver vi detaljerte protokoller for kondisjonering av C. elegans ved masse- og avstandstrening for dannelse av henholdsvis korttidshukommelse (STM) og langtidsminne (LTM). Ved å parre 1-propanol og saltsyre som henholdsvis betinget og ubetinget stimuli, ble C. elegans vellykket trent til å danne aversiv assosiativ STM og LTM. Mens naive dyr ble tiltrukket av 1-propanol, var de trente dyrene ikke lenger eller veldig svakt tiltrukket av 1-propanol. Som i andre organismer som Aplysia og Drosophila, spiller “læring og minnegener” viktige roller i minnedannelse. Spesielt er NMDA-type glutamatreseptorer, uttrykt i bare seks par interneuroner i C. elegans, nødvendig for dannelsen av både STM og LTM, muligens som en tilfeldighetsfaktor. Derfor kan minnesporet ligge blant interneuronene.
Læring og hukommelse er avgjørende for at dyr skal overleve og reprodusere seg ved å navigere effektivt i skiftende miljøer. C. elegans er en attraktiv modellorganisme for å studere læring og minne på molekylære og cellulære nivåer på grunn av enkelheten i nervesystemet, hvis kjemiske og elektriske koblingsskjemaer ble fullstendig rekonstruert fra serielle elektronmikrografer av tynne seksjoner 1,2,3.
C. elegans lærer å assosiere dyrkingstemperatur med sult og migrerer bort fra veksttemperaturen med et aversivt minne som varer i flere timer 4,5. Kondisjonering av C. elegans med natriumklorid (NaCl) i fravær av mat fører til en reduksjon i kjemotaksis mot NaCl 6,7,8. Når parret med mat, er butanon attraksjon forbedret som et resultat av appetittvekkende læring 9,10,11. Selv om disse fenomenene tolkes som assosiativ læring og hukommelse 10,12, er skillet mellom assosiativ læring og ikke-assosiativ sensibilisering, tilvenning og tilpasning ikke klart i C. elegans lærings- og minneparadigme13,14. Faktisk viste dyr betinget med butanon og matmangel (aversiv kondisjonering) deprimert kobling av butanon sensorisk nevron AWC ON for å målrette nevroner ved insulinsignaler fra andre nevroner, inkludert AIA interneuroner, mens dyr betinget med butanon og mat (appetitiv kondisjonering) viste forbedret kobling av AWCON for å målrette nevroner15 . Insulinsignaliseringen forårsaker genuttrykksendringer indusert av nukleær EGL-4 og andre transkripsjonsregulatorer16,17. Dermed har denne aversive og appetitive læringen og minnet analogier med henholdsvis ikke-assosiativ habituation og sensibilisering av presynaptiske sensoriske nevroner i gill-tilbaketrekningsrefleksen i Aplysia18,19.
Ved å koble to kjemikalier som betinget stimulus (CS) og ubetinget stimulus (US), har vi og andre utviklet protokoller for kondisjonering av C. elegans for å danne assosiativ læring og minne uten å bruke mat eller sult som USA20,21,22,23. I denne studien er protokollene modifisert for å kondisjonere dyr med 1-propanol og saltsyre (HCl, pH 4.0) som henholdsvis CS og USA for aversiv læring og korttidshukommelse (STM) og langtidsminne (LTM). Naive C. elegans tiltrekkes av 1-propanol24 og frastøtes av syre25. Når betinget med en blanding av 1-propanol og HCl (pH 4,0), var C. elegans ikke lenger eller svært svakt tiltrukket av 1-propanol.
I denne studien ble alle reagensene holdt på en RT på ~ 18 ° C i gjennomsnitt, og dyr ble dyrket på en benk ved RT for å unngå stress for dyrene. Videre ble alle eksperimentelle prosedyrer utført ved RT. Dyr ble opprinnelig dyrket i en inkubator ved 20 ° C og deretter kondisjonert på en benk ved ~ 24 ° C ved bruk av reagenser ved RT. Under disse forholdene var resultatene av kondisjoneringen svært varierende. Ved lav RT vokser C. elegans sakte og bør dyrkes lenger enn ved 20 ° C til dyrene når det modne voksenstadiet, da yngre voksne dyr er mer følsomme for kjemikaliene som brukes til kondisjonering enn modne voksne dyr og kan vise lavere CI-verdier.
Det mest kritiske trinnet for vellykket kondisjonering er vasking av dyr med ddH2O umiddelbart etter hver kjemisk behandling. Derfor bør mekaniske spenninger og temperaturspenninger minimeres ved å bruke avsagde pipetspisser, holde reagenser ved RT og vaske dyrene veldig forsiktig ved å bevege dyresamleren veldig sakte opp og ned i ddH2O. Grundig vask av dyrene hver gang etter kondisjonering kan påvirke læring og hukommelse. Betingelsene for kjemotaksisanalyseplatene påvirker også resultatene alvorlig. For tørre eller for våte plater hindrer jevn bevegelse av dyrene. Plater ble tilberedt som beskrevet i trinn 1.; en god plate er en som de 4 μL flekkene av ddH2O eller 5% vandig 1-propanol absorberes fullstendig av agar på omtrent 5 minutter etter spotting. Som beskrevet ovenfor er dyrs alder også kritisk for vellykket kondisjonering. Unge voksne dyr er følsomme for mekanisk og kjemisk behandling, noe som resulterer i variable resultater, selv om svært gamle dyr kanskje heller ikke er egnet for kondisjonering.
Holdbarheten til 1-propanol avhenger av merker og partier og er mindre enn 3 måneder ved RT. Når CI-verdiene til naive dyr blir verre, anbefales det å bruke fersk 1-propanol til kondisjonering og kjemotaksisanalyse.
Dannelsen av minne ved massetrening ble ikke påvirket av behandling av dyr med oversettelseshemmere (cykloheksimid og anisomycin) og en transkripsjonshemmer (aktinomycin D), mens dannelsen av minne ved avstandstreningen ble markert hemmet av hemmerne20,21. Videre forfalt det tidligere minnet av kuldesjokk, mens sistnevnte ble beholdt i en lengre periode enn førstnevnte og var motstandsdyktig mot kuldesjokk. Disse resultatene viser at førstnevnte er STM og sistnevnte er LTM, henholdsvis20,21. Imidlertid kan minnet dannet av den masserte treningen bestå av STM og mellomlangsiktig (mellomtids) minne siden STM er svakt avhengig av CREB-transkripsjonsfaktoren (figur 5A). Dette er i samsvar med resultatet at STM ble beholdt i mer enn 1 time20,21. Dannelsen av både STM og LTM er svært avhengig av nmr-1, som bare uttrykkes i seks par nevroner (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG og PVC) i C. elegans27,28. I disse nevronene kan derfor NMDA-reseptorer fungere som en molekylær tilfeldighetsdetektor av 1% vandige 1-propanol- og HCl (pH 4.0) signaler for synaptisk plastisitet, hvor den synaptiske forsterkningen som kreves for både STM og LTM, kan skyldes tilfeldig avfyring av pre- og postsynaptiske nevroner 29,30,31,32,33. Derfor kan det aversive assosiative minnet dannes blant interneuronene.
Metodene beskrevet i denne studien skal være anvendelige for appetitiv olfaktorisk læring og kortsiktig og langsiktig assosiativt minne ved bruk av 1-nonanol som CS og kaliumklorid som US21. Det er interessant å sammenligne nevronkretsene som er involvert i dannelsen av appetittvekkende og aversive minner.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang og Hitomi Ohtaki for teknisk assistanse og kommentarer til manuskriptet. Stammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University.
500 mL beaker | HARIO | B-500-H32 | |
10 µL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-104-96RS-Q | |
0.2 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | TTW110RS-Q | |
1.0 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-111-R100NS-Q | |
1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
2 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
10 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-04 | |
50 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-06 | |
6-well cell culture plate | Costar | 3516 | |
Aron Alpha (Glue for plastic) | Toagosei | High Speed EX | |
Autoclave | Tomy Digital Biology | SX-300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | |
Bacto peptone | BD | 211677 | |
Bottle top 0.2 µm filter units | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
Bunsen burner | EISCO | SKU CH0089A | |
Calcium chloride dihydrate | Nacalai Tesque | 06730-15 | |
C. elegans mutant strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Cholesterol | Wako Pure Chemical Industries | 034-03002 | |
Clear acrylic cylindrical pipe | Asahi Kasei | 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness) | |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-80 | |
Dental burner | Phoenix-Dent | APT-3 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28726-05 | |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Electric pipetter | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Gelatin | Wako Pure Chemical Industries | 073-06295 | |
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) | As One | Trade FLAT Mark | |
Heating magnetic stirrer | Thermo Fisher Scientific | SP131324 | |
Hydrochloric acid | Nacalai Tesque | 37345-15 | |
Incubator | SANYO | MIR-553 | |
Kimwipes S-200 | Nippon Paper Crecia | 62011 | |
Laboratory coat | TOYO LINT FREE | FH240C | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Nacalai Tesque | 21002-85 | |
Magnetic stirrer bar | SANSYO | 93-5412 | |
Metal spatula | FUJIFILM Wako | 647-06531 | |
Nitrile gloves | Kimberly-Clark | KC100 | |
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) | SEFAR | NY30-HD | |
P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
P200 pipetman | Gilson | F123600 | |
P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
pH meter | HORIBA | Navi F-52 | |
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) | IWAKI | SH90-15E | |
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) | SARSTEDT | 82.1194.500 | |
Plastic weighing boats | As One | 1-5233-01 | |
Platinum wire for a worm pick | Nilaco | PT-351265 | |
1-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 279544 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28721-55 | |
Safety goggles | Kimberly-Clark | #25646 | |
Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
Tooth picks | |||
Water purification sysytem | Merck | Elix Essential 10 UV | |
Water urification sysytem | Merck | Milli-Q Synthesis A10 | |
Weighing balance | METTLER | TOREDO | |
Wild type C. elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center |