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Neuroscience

Apprendimento associativo avversivo e formazione della memoria accoppiando due sostanze chimiche in Caenorhabditis elegans

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64137
, ,
1Information Processing Biology Unit,Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University

Summary

Abbiamo precedentemente sviluppato protocolli per Caenorhabditis elegans per formare memorie associative a breve e lungo termine mediante allenamento di massa e distanziato, rispettivamente. Qui, vengono descritti protocolli dettagliati per il condizionamento di C. elegans accoppiando 1-propanolo e acido cloridrico come stimoli condizionati e incondizionati, rispettivamente, per formare memoria associativa avversiva.

Abstract

Il nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello attraente per studiare l’apprendimento e la memoria a livello molecolare e cellulare a causa della semplicità del suo sistema nervoso, i cui schemi elettrici chimici ed elettrici sono stati completamente ricostruiti da micrografie elettroniche seriali di sezioni sottili. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per il condizionamento di C. elegans mediante allenamento di massa e distanziati per la formazione di memoria a breve termine (STM) e memoria a lungo termine (LTM), rispettivamente. Accoppiando 1-propanolo e acido cloridrico come stimoli condizionati e incondizionati, rispettivamente, C. elegans è stato addestrato con successo a formare STM e LTM associativi avversivi. Mentre gli animali ingenui erano attratti dall’1-propanolo, gli animali addestrati non erano più o molto debolmente attratti dall’1-propanolo. Come in altri organismi come Aplysia e Drosophila, i “geni dell’apprendimento e della memoria” svolgono ruoli essenziali nella formazione della memoria. In particolare, i recettori del glutammato di tipo NMDA, espressi in sole sei coppie di interneuroni in C. elegans, sono necessari per la formazione di STM e LTM, possibilmente come fattore di coincidenza. Pertanto, la traccia di memoria può risiedere tra gli interneuroni.

Introduction

L’apprendimento e la memoria sono vitali per gli animali per sopravvivere e riprodursi navigando in modo efficiente in ambienti mutevoli. C. elegans è un organismo modello attraente per studiare l’apprendimento e la memoria a livello molecolare e cellulare a causa della semplicità del suo sistema nervoso, i cui schemi elettrici chimici ed elettrici sono stati completamente ricostruiti da micrografie elettroniche seriali di sezioni sottili 1,2,3.

C. elegans impara ad associare la temperatura di coltivazione alla fame e migra lontano dalla sua temperatura di crescita con una memoria avversiva che dura diverse ore 4,5. Il condizionamento di C. elegans con cloruro di sodio (NaCl) in assenza di cibo porta ad una riduzione della chemiotassi verso NaCl 6,7,8. Se abbinato al cibo, l’attrazione butanone è migliorata come risultato dell’apprendimento appetitivo 9,10,11. Sebbene questi fenomeni siano interpretati come apprendimento associativo e memoria 10,12, la distinzione tra apprendimento associativo e sensibilizzazione, assuefazione e adattamento non associativi non è chiara nel paradigma dell’apprendimento e della memoria di C. elegans 13,14. Infatti, gli animali condizionati con butanone e la privazione alimentare (condizionamento avversivo) hanno mostrato un accoppiamento depresso del neurone sensoriale del butanone AWC ON per colpire i neuroni dai segnali di insulina provenienti da altri neuroni, inclusi gli interneuroni AIA, mentre gli animali condizionati con butanone e cibo (condizionamento appetitivo) hanno mostrato un maggiore accoppiamento di AWCON ai neuroni bersaglio15 . La segnalazione dell’insulina provoca alterazioni dell’espressione genica indotte da EGL-4 nucleare e da altri regolatori trascrizionali16,17. Pertanto, questo apprendimento e memoria avversivi e appetitivi ha analogie con l’assuefazione non associativa e la sensibilizzazione, rispettivamente, dei neuroni sensoriali presinaptici nel riflesso di ritiro branchiale in Aplysia18,19.

Accoppiando due sostanze chimiche come lo stimolo condizionato (CS) e lo stimolo incondizionato (US), noi e altri abbiamo sviluppato protocolli per il condizionamento di C. elegans per formare l’apprendimento associativo e la memoria senza usare cibo o fame come US20,21,22,23. Nel presente studio, i protocolli sono modificati per condizionare gli animali con 1-propanolo e acido cloridrico (HCl, pH 4.0) come CS e US, rispettivamente, per l’apprendimento avverso e la memoria a breve termine (STM) e la memoria a lungo termine (LTM). L’ingenuo C. elegans è attratto dall’1-propanolo24 e respinto dall’acido25. Quando condizionato con una miscela di 1-propanolo e HCl (pH 4,0), C. elegans non era più o molto debolmente attratto da 1-propanolo.

Protocol

1. Ricette Piastre di agar NGM (fase 2.1.)Per preparare piastre NGM da 6 cm, sciogliere 2,5 g di peptone, 3 g di NaCl e 17 g di agar in 850 ml di H 2 O (ddH2O) doppiamente deionizzato. Portare il volume totale a 972 mL con ddH2O. Dopo l’autoclave, raffreddare a ~65 °C e aggiungere 1 mL di 5 mg/mL di colesterolo sciolto in etanolo, 1 mL ciascuno di 1 M CaCl2 e 1 M MgSO4 e 25 mL di 1 M fosfato di potassio (pH 6,0). Dopo aver mescolato bene, erogare 8 ml ciascuno a 6 cm (di diametro) di piastre di Petri. Conservare i piatti con coperchio su un banco a temperatura ambiente (RT) per 1 giorno, quindi tenerli in plastica in una cella frigorifera fino all’uso. Preparare il terreno Luria-Bertani (LB) (fase 2.1.) sciogliendo 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di NaCl in 1 L di ddH2O. Regolare il pH a 7,0 con 5 N NaOH (diverse gocce) e sterilizzare in autoclave.Preparare le piastre LB aggiungendo 15 g di agar al mezzo LB. Dopo l’autoclave, raffreddare a ~60 °C ed erogare 12 ml ciascuna a 9 cm (di diametro) di piastre di Petri. Conservare i piatti in plastica in una cella frigorifera fino all’uso. Per realizzare un raccoglitore di animali (passaggio 2.4.), attaccare la rete di nylon (dimensione della maglia di 30 μm) sul fondo di un tubo cilindrico acrilico trasparente (3,5 cm di lunghezza, 3 cm di diametro esterno, 2 mm di spessore della parete) con colla. Per preparare una soluzione acquosa di gelatina allo 0,25% (fase 2.4.), sciogliere 0,25 g di gelatina in 100 ml di ddH2O. Sterilizzare in autoclave. Piastre per analisi della chemiotassi (fase 5.1.)Per realizzare piastre di agar per il saggio della chemiotassi, sciogliere 15 g di agar in 993 ml di ddH2O mediante autoclave e raffreddare la soluzione a ~65 °C. Quindi, aggiungere 5 ml di fosfato di potassio 1 M autoclavato (pH 6,0), 1 ml di 1 M CaCl2 e 1 ml di 1 M MgSO4 alla soluzione di agar. Tutte queste soluzioni sono sterilizzate separatamente mediante autoclave. Erogare 10 ml della soluzione miscelata in una capsula di Petri da 6 cm. Posizionare questi piatti con coperchi su una panca a RT per due giorni, quindi metterli su tovaglioli di carta bagnati in plastica a RT fino all’uso. Queste piastre possono essere utilizzate fino a 10 giorni. Per ottenere il tampone per il saggio della chemiotassi (fase 5.4.), mescolare 5 ml di fosfato di potassio 1 M (pH 6,0), 1 ml di 1 M CaCl 2, 1 mL di 1 M MgSO4 e 993 ml di ddH2O. Sterilizzare separatamente tutte queste soluzioni mediante autoclave. Per preparare una soluzione di miscela di 40 mL CS/US (1% acquoso 1-propanolo e HCl [pH 4,0]) (fase 3.1. e fase 4.1.), aggiungere 0,4 mL di 1-propanolo assoluto e 4 μL di 5 M HCl (0,1 mM alla concentrazione finale) a 39,6 mL di ddH2O. Mantenere la soluzione a RT. Per fare ddH2O, trattare l’acqua del rubinetto 2x con sistemi di purificazione dell’acqua (fare riferimento alla tabella dei materiali). Preparare una coltura liquida (OD600 = ~0,7) di Escherichia coli OP50 inoculando una colonia fresca con uno stuzzicadenti in 10 ml di terreno LB e incubando a 37 °C per 7-8 ore. I batteri coltivati per un periodo più lungo possono influenzare l’esito del condizionamento, forse a causa di metaboliti secondari. 2. Preparazione di C. sincronizzato.  elegans Utilizzando i metodi standard26, coltivare animali su piastre NGM da 6 cm (passo 1.1.). Le piastre NGM vengono preparate spargendo 0,2 ml di una coltura liquida di E. coli OP50 in mezzo LB (vedi punto 1.9 .) e incubando a RT per non più di 24 ore (i batteri vecchi possono influenzare l’esito del condizionamento).NOTA: L’apprendimento e la memoria di C. elegans sono estremamente sensibili alle sollecitazioni meccaniche, chimiche e di temperatura. Pertanto, si raccomanda vivamente di coltivare animali, mantenere tutti i reagenti compresa l’acqua ed eseguire tutti i test a RT tra 17 ° C e 20 ° C. Devono essere evitate stimolazioni fisiche e meccaniche come vortexing, pipettaggio ruvido e centrifugazione. L’1-propanolo fresco deve essere usato ogni 3 mesi al massimo per un motivo sconosciuto. È importante sottolineare che gli animali devono essere coltivati con cibo in abbondanza poiché la fame può influire seriamente sull’esito del condizionamento. Il giorno 1, raccogli e posiziona cinque animali gravidi ben nutriti (metti più animali mutanti che depongono le uova lentamente) su ciascuna delle quattro piastre NGM da 6 cm con un raccoglitore di vermi di platino e lasciali deporre ~ 50 uova per 3 ore a RT per ottenere una popolazione sincronizzata di animali adulti. Interrompere la deposizione delle uova rimuovendo gli animali genitori dai piatti con un raccoglitore di lombrichi di platino.NOTA: I piatti seminati devono essere tenuti a RT per ridurre al minimo lo stress per gli animali. Coltiva gli animali a RT per circa 5 giorni, che è il tempo necessario agli animali per raggiungere il loro stadio adulto maturo, non lo stadio di giovane adulto.NOTA: Il periodo di coltivazione compreso tra 4,5 giorni e 5,5 giorni deve essere regolato in funzione delle condizioni, poiché gli animali adulti più giovani sono più sensibili alle sostanze chimiche utilizzate per il condizionamento rispetto agli animali adulti maturi (Figura supplementare 1). Dopo il condizionamento, gli animali adulti più giovani possono mostrare valori più bassi dell’indice di chemiotassi (C.I.). Raccogliere ~ 200 animali adulti in un raccoglitore di animali (vedere il passaggio 1.4.) lavando ogni piastra con 1 ml di gelatina acquosa allo 0,25% (fase 1.4.) Questa gelatina acquosa impedisce l’adesione degli animali alla superficie di materie plastiche come le punte delle pipette. Lavare gli animali nel collettore con ddH 2 O (passo 1.8.) muovendo molto delicatamente il collettore su e giù 2x in ~10 mL di ddH 2 O.Ripetere questo processo 2 volte di più (3x in totale) con ~ 10 ml di ddH2O ciascuno per prevenire la contaminazione batterica.NOTA: La contaminazione batterica influisce seriamente sulla chemiotassi degli animali. 3. Formazione di massa per l’apprendimento associativo a breve termine e la memoria NOTA: vedere la Figura 1 per il flusso di lavoro di formazione di massa. Immergere delicatamente il raccoglitore animale contenente ~200 animali in 40 ml di una miscela di 1-propanolo all’1% e HCl (pH 4,0 dopo miscelazione con 1-propanolo; vedere punto 1.7.) in una capsula cristallizzante per ~1 s.NOTA: Per gli animali di controllo, fare lo stesso ma immergere solo in 1-propanolo acquoso all’1%. Sarebbe meglio trattare gli animali con HCl (pH 4,0) solo come un altro controllo. Lavare gli animali nel collettore immergendo molto delicatamente il collettore 1x in 10 ml di ddH2O in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti.NOTA: questa fase di lavaggio deve essere molto delicata e deve essere eseguita solo 1 volta poiché un lavaggio prolungato può impedire l’apprendimento. Ripetere i passaggi 3.1. e 3.2. 10x senza interruzione (intervallo tra prove [ITI], 0 min).NOTA: UtilizzareddH 2O fresco ogni volta su RT. Posizionare il collettore su un prato di E. coli OP50 su una piastra NGM di 6 cm per 10 minuti a RT in modo che gli animali possano riposare. Lavare gli animali nel collettore con ddH 2 O muovendo molto delicatamente il collettore su e giù 2x in ~10 mL di ddH 2 O.Ripetere questo processo 2 volte di più (3x in totale) con ~ 10 ml di ddH2O ciascuno per prevenire la contaminazione batterica. Procedere al test della chemiotassi come descritto di seguito (fase 5). 4. Formazione distanziata per l’apprendimento associativo a lungo termine e la memoria NOTA: vedere la Figura 2 per il flusso di lavoro di formazione distanziato. Immergere delicatamente un raccoglitore di animali contenente ~ 200 animali in 40 ml di una miscela di 1% di 1-propanolo e HCl (pH 4,0 dopo miscelazione con 1-propanolo; vedere il punto 1.7.) in una capsula cristallizzante per ~ 1,0 s.NOTA: Fare lo stesso con 1% acquoso 1-propanolo solo come controllo. Sarebbe meglio trattare gli animali con HCl (pH 4,0) solo come un altro controllo. Lavare gli animali nel collettore immergendo molto brevemente il collettore 1x in 10 ml di ddH2O in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti.NOTA: Questo lavaggio deve essere molto breve in quanto un lavaggio prolungato può impedire l’apprendimento. Posizionare il collettore su un prato di E. coli OP50 su una piastra di agar NGM in una piastra di Petri di 6 cm (di diametro) per 10 minuti a RT in modo che gli animali possano riposare.NOTA: Questo riposo per 10 minuti come ITI è fondamentale per gli animali per consolidare i ricordi per la formazione di LTM. Ripetere i passaggi 4.1.-4.3. 10x. Lavare gli animali nel collettore con ddH 2 O muovendo molto delicatamente il collettore su e giù 2x in ~ 10 ml di ddH 2 O, cheviene mantenuto a RT. Ripetere questo processo 2 volte di più (3x in totale) con ~ 10 ml di ddH2O ciascuno per prevenire la contaminazione batterica. Procedere al test della chemiotassi come descritto di seguito (fase 5.). 5. Saggio della chemiotassi Preparare piastre di agar per il test della chemiotassi in piastre di Petri di plastica da 6 cm (vedere il punto 1.5.). Trasferire gli animali nel collettore (fase 2.5.), che viene posto su una superficie piana di un coperchio di plastica della capsula di Petri, in una provetta da microcentrifuga da 2 ml con 1 ml di gelatina acquosa allo 0,25% utilizzando una punta di pipetta segata con un’apertura di >1 mm (diametro interno).NOTA: è importante utilizzare una punta per pipetta segata per ridurre al minimo lo stress di taglio sugli animali. Rimuovere il surnatante dal tubo dopo che gli animali si sono depositati sul fondo del tubo per gravità per ~ 1 minuto (non centrifugare). Risospendere delicatamente gli animali in 1 mL di tampone per chemiotassi (vedere punto 1.6.) e lasciarli depositare per gravità sul fondo del tubo per ~1 minuto (non centrifugare). Rimuovere il più possibile il surnatante mediante pipettaggio. Nel frattempo, individuare diagonalmente 4 μL ciascuno di 1-propanolo acquoso al 5% in due punti e spot 4 μL ciascuno di ddH2O in altri due punti nello stesso modo, come mostrato nella Figura 3A. Per il test di chemiotassi di mutanti che hanno una minore sensibilità all’1-propanolo, individuare concentrazioni più elevate di 1-propanolo acquoso che si traducono in ~ 0,6 valori di indice di chemiotassi (C.I.) di mutanti naïve, come mostrato nella Tabella supplementare 1.NOTA: è importante completare le procedure di avvistamento il più rapidamente possibile. Spot 5% acquoso 1-propanolo poiché 1% acquoso 1-propanolo è troppo debole per attirare gli animali nel test chemiotassi. Al contrario, utilizzare 1-propanolo acquoso all’1% per il condizionamento poiché gli animali trattati con concentrazioni più elevate di 1-propanolo acquoso rispetto all’1% mostrano valori di C.I. inferiori. Individuare 6 μL di porzioni della sospensione animale in tampone per chemiotassi (fase 5.4.) contenente ~60 animali al centro di tre piastre per il test di chemiotassi utilizzando una punta di pipetta segata con un’apertura di ~ 1,0 mm (diametro interno). Rimuovere il liquido il più possibile con uno stoppino di tessuto da laboratorio senza toccare gli animali e posizionare un coperchio sul piatto.NOTA: è importante completare queste procedure il più rapidamente possibile. Lasciare che gli animali si muovano liberamente sulla piastra per 10 minuti a RT, quindi trasferire la piastra in una capsula di Petri di vetro sul ghiaccio per 3 minuti per fermare la chemiotassi. Quindi, conservare il piatto in frigorifero fino a contare il numero di animali sul piatto. Contare il numero di animali in quattro sezioni, ad eccezione di quelli nel cerchio centrale, sotto uno stereomicroscopio e calcolare l’indice di chemiotassi (C.I.) utilizzando l’equazione mostrata nella Figura 3B. Dai valori C.I., calcolare i valori dell’indice di apprendimento (L.I.) come differenza tra il valore C.I. degli animali di riferimento e il valore C.I. degli animali condizionati (L.I. = C.I.reference- C.I.conditioned).NOTA: Il valore C.I. degli animali di riferimento (riferimento C.I.) è il valore medio dei valori C.I. degli animali condizionati con solo 1-propanolo acquoso all’1%.

Representative Results

C. elegans è stato condizionato da un allenamento di massa per formare memoria associativa avversiva a breve termine accoppiando 1% acquoso 1-propanolo e HCl (pH 4,0) come CS e US, rispettivamente. Secondo il protocollo sopra descritto, gli animali sincronizzati sono stati coltivati su un banco ad un RT di 18 °C per 5 giorni e sono stati lavati molto delicatamente 2 volte con ddH2O ad un RT di 18 °C. Quindi, gli animali sono stati condizionati con una miscela di 1-propanolo acquoso all’1% e HCl (pH 4,0) per 1 s. Abbiamo anche addestrato animali con solo ddH2O, solo 1% acquoso 1-propanolo e HCl (pH 4.0) solo come riferimenti. Dopo il condizionamento, gli animali sono stati lavati 1x con ddH2O. Abbiamo ripetuto il condizionamento 10 volte senza interruzione (senza ITI). Il condizionamento riuscito è stato ottenuto ripetendo la procedura più di 7x fino a 10x. Il condizionamento più di 10 volte ha comportato un apprendimento meno efficiente21. Dopo l’addestramento, gli animali hanno riposato su cibo batterico per 10 minuti a RT (18 ° C). Dopo essere stati lavati con ddH2O 3x, gli animali sono stati trasferiti in una provetta di microcentrifuga sospendendo in gelatina acquosa allo 0,25% e depositati sul fondo per gravità. Dopo aver rimosso il surnatante il più possibile, gli animali sono stati delicatamente risospesi in un tampone di chemiotassi e quindi lasciati depositare sul fondo del tubo per gravità. Dopo aver rimosso il più possibile il surnatante è stata individuata sulla sospensione animale sul cerchio centrale di una piastra di analisi della chemiotassi, che è stata mantenuta a un RT di 18 °C, e quindi gli animali sono stati autorizzati a muoversi liberamente sulla piastra per 10 minuti a un RT di 18 °C. I valori C.I. sono stati calcolati utilizzando l’equazione mostrata nella Figura 3B. Come mostrato nella Figura 4A, gli animali condizionati con la miscela di 1-propanolo all’1% e HCl non erano più attratti dal 5% di 1-propanolo individuato sulle piastre di agar per il test della chemiotassi, mentre gli animali naïve e di riferimento erano similmente attratti dal 5% di 1-propanolo. Dopo l’allenamento di massa (fase 3.), la memoria non è stata più osservata entro 3 h20. Inoltre, la memoria formata dall’allenamento di massa era sensibile allo shock freddo20. Questi risultati dimostrano che C. elegans ha formato con successo STM avversivo mediante addestramento di massa. Gli animali sono stati anche condizionati da un addestramento distanziato di 10 volte con un ITI di 10 minuti tra le fasi di addestramento (fase 4.). Durante l’ITI, il collettore con gli animali è stato posizionato su un prato batterico su una piastra NGM di 6 cm ad un RT di 18 °C. Gli animali condizionati dall’addestramento distanziato con una miscela di 1-propanolo acquoso all’1% e HCl (pH 4,0) non erano più attratti dal 5% di 1-propanolo rispetto agli animali trattati solo con 1% di 1-propanolo, solo HCl (pH 4,0) o solo ddH2O (Figura 4B). Dopo l’addestramento distanziato, gli animali hanno conservato la memoria per più di 12 h20,21. Inoltre, la memoria non si è formata quando gli animali sono stati trattati con inibitori della traduzione o della trascrizione ed era resistente allo shock da freddo20,21. Pertanto, C. elegans ha formato con successo LTM avversivo mediante addestramento distanziato. Abbiamo anche esaminato gli effetti delle mutazioni nei “geni dell’apprendimento e della memoria” sulla formazione di STM e LTM. Il gene crh-1 codifica per l’onnipresente fattore di trascrizione cAMP-response element-binding protein (CREB), glr-1 e nmr-1 codificano rispettivamente per le subunità del recettore del glutammato di tipo α-ammino-3-idrossil-5-metil-4-isoxazolepropionico (AMPA) e del recettore del glutammato di tipo N-metil-D-aspartato (NMDA), e stau-1 codifica per l’isoforma Staufen della proteina legante l’RNA a doppio filamento. Questi geni svolgono un ruolo essenziale nel condizionamento classico in C. elegans, Drosophila, Aplysia e topi. Utilizzando una miscela di 1-propanolo acquoso all’1% e HCl (pH 4,0), la formazione di STM e LTM dipendeva da tutti i geni (Figure 5A,B). Figura 1: Schema sperimentale della formazione di massa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Schema sperimentale dell’addestramento spaziato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Saggio di chemiotassi e indice di chemiotassi. (A) Rappresentazione schematica di una piastra di saggio di chemiotassi. Le piastre di Petri (6 cm di diametro) sono state separate in quattro aree come mostrato e 4 μL ciascuna di 1-propanolo acquoso al 5% o ddH 2 O sono state individuate diagonalmente in due punti ciascuna, a2cm di distanza dal centro. (B) I valori dell’indice di chemiotassi sono stati calcolati dall’equazione mostrata contando il numero di animali nelle aree “a” e “b” dopo il completamento della chemiotassi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Valori dell’indice di chemiotassi degli animali condizionati con sostanze chimiche. Gli animali N2 wild-type sincronizzati sono stati condizionati con sostanze chimiche indicate da (A) addestramento di massa 10x o (B) addestramento distanziato 10x. I diagrammi di flusso dei protocolli di allenamento di massa e distanziati utilizzati sono mostrati rispettivamente nella Figura 1 e nella Figura 2. Dopo il condizionamento, gli animali sono stati liberi di muoversi per 10 minuti su una piastra di agar di 6 cm per il test della chemiotassi a un RT di 18 °C. I valori C.I. sono stati calcolati utilizzando l’equazione mostrata nella Figura 3B. I dati relativi a questa cifra sono riportati nella tabella supplementare 1. I dati degli animali ingenui sono stati ritracciati in entrambi i pannelli di figure. Il grafico a barre mostra il 1° quartile, la mediana e il 3° quartile. Gli asterischi (*P < 0,05) indicano differenze statisticamente significative determinate da ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Valori dell’indice di apprendimento di animali mutanti condizionati. Gli animali selvatici sincronizzati N2 e mutanti indicati sono stati condizionati con una miscela di 1-propanolo acquoso all’1% e HCl (pH 4,0) mediante (A) addestramento di massa 10x o (B) allenamento distanziato 10x. I diagrammi di flusso dei protocolli di allenamento di massa e distanziati utilizzati sono mostrati rispettivamente nella Figura 1 e nella Figura 2. Dopo il condizionamento, gli animali sono stati liberi di muoversi per 10 minuti su una piastra di agar di 6 cm per il test della chemiotassi a un RT di 18 °C. I dati relativi a questa cifra sono riportati nella tabella supplementare 2. Il grafico a barre mostra il 1° quartile, la mediana e il 3° quartile. Gli asterischi (*P < 0,05) indicano differenze statisticamente significative determinate da ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Dunnett. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura supplementare 1: Gli animali giovani adulti sono sensibili al trattamento chimico. Gli animali selvatici N2 del giorno 4 e del giorno 5 dopo la schiusa sono stati addestrati in massa 10 volte con HCl, pH 4,0, senza interruzione e sono stati quindi analizzati per la chemiotassi al 5% di 1-propanolo acquoso. Le barre sono mezzi ± S.E.M. (n = 19). Gli asterischi (*P < 0,05) indicano differenze statisticamente significative determinate dall'ANOVA bidirezionale seguito dal test post-hoc di Tukey-Kramer. Clicca qui per scaricare questo file. Tabella supplementare 1: Dati corrispondenti alla figura 4. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella supplementare 2: Dati corrispondenti alla figura 5. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Nel presente studio, tutti i reagenti sono stati mantenuti a un RT di ~ 18 ° C in media e gli animali sono stati coltivati su una panchina presso l’RT per evitare stress agli animali. Inoltre, tutte le procedure sperimentali sono state eseguite presso l’RT. Gli animali sono stati inizialmente coltivati in un’incubatrice a 20 ° C e poi condizionati su un banco a ~ 24 ° C utilizzando reagenti a RT. In queste condizioni, i risultati del condizionamento erano molto variabili. A basso RT, C. elegans cresce lentamente e dovrebbe essere coltivato più a lungo di 20 °C fino a quando gli animali raggiungono lo stadio maturo dell’età adulta, poiché gli animali adulti più giovani sono più sensibili alle sostanze chimiche utilizzate per il condizionamento rispetto agli animali adulti maturi e possono mostrare valori di C.I. più bassi.

Il passo più critico per un condizionamento efficace è il lavaggio degli animali con ddH2O immediatamente dopo ogni trattamento chimico. Pertanto, le sollecitazioni meccaniche e di temperatura dovrebbero essere ridotte al minimo utilizzando punte di pipette segate, mantenendo i reagenti a RT e lavando molto delicatamente gli animali muovendo molto lentamente il raccoglitore animale su e giù in ddH2O. Un lavaggio accurato degli animali ogni volta dopo il condizionamento può influire sull’apprendimento e sulla memoria. Anche le condizioni delle piastre di chemiotassi influenzano gravemente i risultati. Piastre troppo asciutte o troppo bagnate impediscono la locomozione regolare degli animali. Le lastre sono state preparate come descritto al punto 1.; una buona piastra è quella per cui i 4 μL di punti ddH2O o 5% acquoso 1-propanolo sono completamente assorbiti dall’agar in circa 5 minuti dopo l’individuazione. Come descritto sopra, anche le età degli animali sono fondamentali per un condizionamento di successo. Gli animali giovani adulti sono sensibili al trattamento meccanico e chimico, con risultati variabili, sebbene anche gli animali molto anziani potrebbero non essere adatti al condizionamento.

La durata di conservazione di 1-propanolo dipende dalle marche e dai lotti ed è inferiore a 3 mesi a RT. Quando i valori di C.I. degli animali ingenui peggiorano, si consiglia di utilizzare 1-propanolo fresco per il test di condizionamento e chemiotassi.

La formazione della memoria mediante addestramento di massa non è stata influenzata dal trattamento di animali con inibitori della traduzione (cicloeximide e anisocicina) e un inibitore della trascrizione (actinomicina D), mentre la formazione della memoria da parte dell’allenamento distanziato è stata marcatamente inibita dagli inibitori20,21. Inoltre, la prima memoria decadeva per shock freddo, mentre la seconda veniva conservata per un periodo più lungo della prima ed era resistente alle scosse fredde. Questi risultati dimostrano che il primo è STM e il secondo è LTM, rispettivamente20,21. Tuttavia, la memoria formata dall’allenamento di massa può consistere in STM e memoria a medio termine (a medio termine) poiché STM è debolmente dipendente dal fattore di trascrizione CREB (Figura 5A). Ciò è coerente con il risultato che l’STM è stato mantenuto per più di 1 ora20,21. La formazione di STM e LTM è fortemente dipendente da nmr-1, che è espresso solo in sei coppie di neuroni (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG e PVC) in C. elegans27,28. In questi neuroni, quindi, i recettori NMDA possono agire come rivelatori di coincidenza molecolare di segnali acquosi 1-propanolo e HCl (pH 4.0) all’1% per la plasticità sinaptica, dove il rafforzamento sinaptico richiesto sia per STM che LTM può derivare dall’attivazione casuale di neuroni pre- e post-sinaptici 29,30,31,32,33. Pertanto, la memoria associativa avversiva può formarsi tra gli interneuroni.

I metodi descritti nel presente studio dovrebbero essere applicabili per l’apprendimento olfattivo appetitivo e la memoria associativa a breve e lungo termine utilizzando 1-nonanolo come CS e cloruro di potassio come US21. È interessante confrontare i circuiti neuronali coinvolti nella formazione di ricordi appetitivi e avversivi.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Siamo grati a Takashi Murayama, Ei-ichiro Saita, Iou Ven Chang e Hitomi Ohtaki per la loro assistenza tecnica e i commenti sul manoscritto. I ceppi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center, finanziato dal NIH National Center for Research Resources (NCRR). Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento dell’Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University.

Materials

500 mL beaker HARIO B-500-H32
10 µL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips Thermo Fisher Scientific H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes Eppendorf 0030120086
2 mL plastic tubes Eppendorf 0030120094
10 mL Serological pipettes As One 2-5237-04
50 mL Serological pipettes As One 2-5237-06
6-well cell culture plate Costar 3516
Aron Alpha (Glue for plastic) Toagosei High Speed EX
Autoclave Tomy Digital Biology SX-300
Bacto agar BD 214010
Bacto peptone BD 211677
Bottle top 0.2 µm filter units Thermo Fisher Scientific 566-0020
Bunsen burner EISCO SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate Nacalai Tesque 06730-15
C. elegans mutant strains Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol Wako Pure Chemical Industries 034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe Asahi Kasei 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish Pyrex 3140-80
Dental burner Phoenix-Dent APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate Nacalai Tesque 28726-05
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter Drummond Scientific 4-000-101
Gelatin Wako Pure Chemical Industries 073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) As One  Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer Thermo Fisher Scientific SP131324
Hydrochloric acid Nacalai Tesque 37345-15
Incubator SANYO MIR-553
Kimwipes S-200 Nippon Paper Crecia 62011
Laboratory coat TOYO LINT FREE FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate Nacalai Tesque 21002-85
Magnetic stirrer bar SANSYO 93-5412
Metal spatula FUJIFILM Wako 647-06531
Nitrile gloves Kimberly-Clark KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) SEFAR NY30-HD
P10 pipetman Gilson F144802
P200 pipetman Gilson F123600
P1000 pipetman Gilson F123602
pH meter HORIBA  Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) IWAKI SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) SARSTEDT 82.1194.500
Plastic weighing boats As One 1-5233-01
Platinum wire for a worm pick Nilaco PT-351265
1-Propanol SIGMA-ALDRICH 279544
Potassium dihydrogen phosphate Nacalai Tesque 28721-55
Safety goggles Kimberly-Clark #25646
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-05
Stereomicroscope Olympus SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem Merck Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem Merck Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance METTLER  TOREDO
Wild type C. elegans strain N2 Caenorhabditis Genetics Center
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References

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Shibutani, M., Vibulyaseck, S., Maruyama, I. N. Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (184), e64137, doi:10.3791/64137 (2022).
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