التعلم الترابطي الانعكاسي وتكوين الذاكرة عن طريق إقران مادتين كيميائيتين في Caenorhabditis elegans
Summary
لقد طورنا سابقا بروتوكولات ل Caenorhabditis elegans لتشكيل ذكريات ترابطية قصيرة وطويلة المدى من خلال التدريب الجماعي والمتباعد ، على التوالي. هنا ، يتم وصف بروتوكولات مفصلة لتكييف C. elegans عن طريق إقران 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك كمحفزات مشروطة وغير مشروطة ، على التوالي ، لتشكيل ذاكرة ترابطية مكروهة.
Abstract
الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans هي كائن نموذجي جذاب لدراسة التعلم والذاكرة على المستويين الجزيئي والخلوي بسبب بساطة نظامها العصبي ، الذي تم إعادة بناء مخططات الأسلاك الكيميائية والكهربائية بالكامل من الصور المجهرية الإلكترونية التسلسلية للمقاطع الرقيقة. هنا ، نصف بروتوكولات مفصلة لتكييف C. elegans من خلال التدريب الجماعي والمتباعد لتشكيل الذاكرة قصيرة المدى (STM) والذاكرة طويلة المدى (LTM) ، على التوالي. من خلال إقران 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك كمحفزات مشروطة وغير مشروطة ، على التوالي ، تم تدريب C. elegans بنجاح لتشكيل STM الترابطي المكروه و LTM. بينما انجذبت الحيوانات الساذجة إلى 1-بروبانول ، لم تعد الحيوانات المدربة تنجذب أو ضعيفة جدا إلى 1-بروبانول. كما هو الحال في الكائنات الحية الأخرى مثل Aplysia و Drosophila ، تلعب “جينات التعلم والذاكرة” أدوارا أساسية في تكوين الذاكرة. على وجه الخصوص ، مستقبلات الغلوتامات من نوع NMDA ، معبرا عنها في ستة أزواج فقط من الخلايا العصبية البينية في C. elegans ، مطلوبة لتشكيل كل من STM و LTM ، ربما كعامل مصادفة. لذلك ، قد يكون تتبع الذاكرة موجودا بين الخلايا العصبية البينية.
Introduction
التعلم والذاكرة أمران حيويان للحيوانات للبقاء على قيد الحياة والتكاثر من خلال التنقل بكفاءة في البيئات المتغيرة. C. elegans هو كائن نموذجي جذاب لدراسة التعلم والذاكرة على المستويين الجزيئي والخلوي بسبب بساطة نظامه العصبي ، الذي تم إعادة بناء مخططات الأسلاك الكيميائية والكهربائية بالكامل من الصور المجهرية الإلكترونية التسلسلية للأقسام الرقيقة1،2،3.
يتعلم C. elegans ربط درجة حرارة الزراعة بالمجاعة ويهاجر بعيدا عن درجة حرارة نموه بذاكرة مكروهة تدوم لعدة ساعات 4,5. يؤدي تكييف C. elegans مع كلوريد الصوديوم (NaCl) في غياب الطعام إلى انخفاض في الانجذاب الكيميائي نحو كلوريد الصوديوم6،7،8. عند إقرانه بالطعام ، يتم تعزيز جاذبية البوتانون نتيجة للتعلم الفاتح للشهية9،10،11. على الرغم من تفسير هذه الظواهر على أنها التعلم الترابطي والذاكرة 10,12 ، إلا أن التمييز بين التعلم الترابطي والتوعية غير الترابطية والتعود والتكيف غير واضح في نموذج التعلم والذاكرة C. elegans 13,14. في الواقع ، أظهرت الحيوانات المشروطة بالبيوتانون والحرمان من الطعام (التكييف المكروه) اقتران مكتئب للخلية العصبية الحسية للبيوتانون AWC ON لاستهداف الخلايا العصبية عن طريق إشارات الأنسولين من الخلايا العصبية الأخرى ، بما في ذلك الخلايا العصبية البينية AIA ، بينما أظهرت الحيوانات المشروطة بالبيوتانون والطعام (التكييف الفاتح للشهية) اقتران معزز ل AWCON لاستهداف الخلايا العصبية15 . تسبب إشارات الأنسولين تغيرات في التعبير الجيني الناجم عن EGL-4 النووي ومنظمات النسخ الأخرى16,17. وبالتالي ، فإن هذا التعلم والذاكرة المكروهة والشهية لها أوجه تشابه مع التعود والتوعية غير الترابطية ، على التوالي ، للخلايا العصبية الحسية قبل المشبكية في منعكس الانسحاب الخيشومي في Aplysia18,19.
من خلال إقران مادتين كيميائيتين مثل التحفيز المشروط (CS) والتحفيز غير المشروط (الولايات المتحدة) ، قمنا نحن وآخرون بتطوير بروتوكولات لتكييف C. elegans لتشكيل التعلم الترابطي والذاكرة دون استخدام الطعام أو الجوع مثل الولايات المتحدة20،21،22،23. في هذه الدراسة ، تم تعديل البروتوكولات لتكييف الحيوانات مع 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 4.0) مثل CS والولايات المتحدة ، على التوالي ، للتعلم المكروه والذاكرة قصيرة المدى (STM) والذاكرة طويلة المدى (LTM). تنجذب C. elegans الساذجة إلى 1-بروبانول24 وتصدها حمض25. عندما تكون مشروطة بمزيج من 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 4.0) ، لم تعد C. elegans تنجذب أو ضعيفة جدا إلى 1-بروبانول.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الدراسة الحالية ، تم الاحتفاظ بجميع الكواشف عند RT ~ 18 °C في المتوسط ، وتم تربية الحيوانات على مقعد في RT لتجنب الإجهاد للحيوانات. علاوة على ذلك ، تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية في RT. تم تربية الحيوانات في البداية في حاضنة عند 20 درجة مئوية ثم تكييفها على مقعد عند ~ 24 درجة مئوية باستخدام الكواشف في RT. في ظل هذه الظروف ، كانت نتائج التكييف متغيرة للغاية. عند انخفاض RT ، تنمو C. elegans ببطء ويجب زراعتها لفترة أطول من 20 درجة مئوية حتى تصل الحيوانات إلى مرحلة البلوغ الناضجة ، حيث أن الحيوانات البالغة الأصغر سنا أكثر حساسية للمواد الكيميائية المستخدمة في التكييف من الحيوانات البالغة الناضجة وقد تظهر قيم CI أقل.
الخطوة الأكثر أهمية للتكييف الناجح هي غسل الحيوانات باستخدام ddH2O مباشرة بعد كل معالجة كيميائية. لذلك ، يجب تقليل الضغوط الميكانيكية ودرجة الحرارة باستخدام أطراف الماصة المنشورة ، والحفاظ على الكواشف في RT ، وغسل الحيوانات بلطف شديد عن طريق تحريك جامع الحيوانات ببطء شديد لأعلى ولأسفل في ddH2O. قد يؤثر الغسيل الشامل للحيوانات في كل مرة بعد التكييف على التعلم والذاكرة. تؤثر ظروف لوحات فحص الانجذاب الكيميائي أيضا بشدة على النتائج. لوحات جافة جدا أو رطبة جدا تمنع الحركة السلسة للحيوانات. تم إعداد اللوحات كما هو موضح في الخطوة 1.; الصفيحة الجيدة هي الصفيحة التي يمتص فيها الآجار تماما بقع 4 ميكرولتر من ddH2O أو 5٪ مائي 1-بروبانول في حوالي 5 دقائق بعد اكتشافها. كما هو موضح أعلاه ، فإن أعمار الحيوانات ضرورية أيضا لتكييف ناجح. الحيوانات البالغة من العمر حساسة للمعالجة الميكانيكية والكيميائية ، مما يؤدي إلى نتائج متغيرة ، على الرغم من أن الحيوانات المسنة جدا قد لا تكون مناسبة للتكييف أيضا.
تعتمد مدة صلاحية 1-بروبانول على العلامات التجارية والكثير وهي أقل من 3 أشهر في RT. عندما تزداد قيم CI للحيوانات الساذجة سوءا ، يوصى باستخدام 1-بروبانول طازج لفحص التكييف والانجذاب الكيميائي.
لم يتأثر تكوين الذاكرة عن طريق التدريب الجماعي بمعالجة الحيوانات بمثبطات الترجمة (سيكلوهيكسيميد وأنيسوميسين) ومثبط النسخ (أكتينومايسين د) ، في حين تم تثبيط تكوين الذاكرة بواسطة التدريب المتباعد بشكل ملحوظ بواسطة مثبطات20,21. علاوة على ذلك ، اضمحلت الذاكرة الأولى بسبب الصدمة الباردة ، بينما تم الاحتفاظ بالأخيرة لفترة أطول من الأولى وكانت مقاومة للصدمة الباردة. توضح هذه النتائج أن الأول هو STM والأخير هو LTM ، على التوالي20,21. ومع ذلك ، قد تتكون الذاكرة التي يشكلها التدريب الجماعي من STM والذاكرة متوسطة المدى (متوسطة المدى) لأن STM تعتمد بشكل ضعيف على عامل نسخ CREB (الشكل 5 أ). هذا يتفق مع النتيجة التي تم الاحتفاظ بها STM لأكثر من 1 ساعة20,21. يعتمد تكوين كل من STM و LTM بشكل كبير على nmr-1 ، والذي يتم التعبير عنه فقط في ستة أزواج من الخلايا العصبية (AVA ، AVD ، AVE ، RIM ، AVG ، و PVC) في C. elegans27,28. في هذه الخلايا العصبية ، لذلك ، قد تعمل مستقبلات NMDA ككاشف مصادفة جزيئية لإشارات 1٪ مائية 1-بروبانول وحمض الهيدروكلوريك (pH 4.0) للدونة المشبكية ، حيث يمكن أن ينتج التقوية المشبكية المطلوبة لكل من STM و LTM عن إطلاق عرضي للخلايا العصبية قبل وبعد المشبكي29،30،31،32،33. لذلك ، قد تتشكل الذاكرة الترابطية المكروهة بين الخلايا العصبية البينية.
يجب أن تكون الطرق الموضحة في الدراسة الحالية قابلة للتطبيق على التعلم الشمي الفاتح للشهية والذاكرة الترابطية قصيرة المدى وطويلة المدى باستخدام 1-nonanol مثل CS وكلوريد البوتاسيوم مثل US21. من المثير للاهتمام مقارنة الدوائر العصبية التي تشارك في تكوين ذكريات شهية ومكروهة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لتاكاشي موراياما وإي-إيتشيرو سايتا وإيو فين تشانغ وهيتومي أوتاكي على مساعدتهم الفنية وتعليقاتهم على المخطوطة. تم توفير السلالات من قبل مركز Caenorhabditis Genetics Center ، الذي يموله المركز الوطني لموارد الأبحاث (NCRR). تم دعم هذا العمل بتمويل من معهد أوكيناوا للعلوم والتكنولوجيا جامعة الدراسات العليا.
Materials
| 500 mL beaker | HARIO | B-500-H32 | |
| 10 µL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-104-96RS-Q | |
| 0.2 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | TTW110RS-Q | |
| 1.0 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-111-R100NS-Q | |
| 1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 10 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-04 | |
| 50 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-06 | |
| 6-well cell culture plate | Costar | 3516 | |
| Aron Alpha (Glue for plastic) | Toagosei | High Speed EX | |
| Autoclave | Tomy Digital Biology | SX-300 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bottle top 0.2 µm filter units | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Bunsen burner | EISCO | SKU CH0089A | |
| Calcium chloride dihydrate | Nacalai Tesque | 06730-15 | |
| C. elegans mutant strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Cholesterol | Wako Pure Chemical Industries | 034-03002 | |
| Clear acrylic cylindrical pipe | Asahi Kasei | 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness) | |
| Crystallizing dish | Pyrex | 3140-80 | |
| Dental burner | Phoenix-Dent | APT-3 | |
| Di-potassium hydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28726-05 | |
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Electric pipetter | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Gelatin | Wako Pure Chemical Industries | 073-06295 | |
| Glass Petri dishes (10 cm in diameter) | As One | Trade FLAT Mark | |
| Heating magnetic stirrer | Thermo Fisher Scientific | SP131324 | |
| Hydrochloric acid | Nacalai Tesque | 37345-15 | |
| Incubator | SANYO | MIR-553 | |
| Kimwipes S-200 | Nippon Paper Crecia | 62011 | |
| Laboratory coat | TOYO LINT FREE | FH240C | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Nacalai Tesque | 21002-85 | |
| Magnetic stirrer bar | SANSYO | 93-5412 | |
| Metal spatula | FUJIFILM Wako | 647-06531 | |
| Nitrile gloves | Kimberly-Clark | KC100 | |
| Nylon mesh (mesh size: 30 μm) | SEFAR | NY30-HD | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P200 pipetman | Gilson | F123600 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| pH meter | HORIBA | Navi F-52 | |
| Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) | IWAKI | SH90-15E | |
| Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) | SARSTEDT | 82.1194.500 | |
| Plastic weighing boats | As One | 1-5233-01 | |
| Platinum wire for a worm pick | Nilaco | PT-351265 | |
| 1-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 279544 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28721-55 | |
| Safety goggles | Kimberly-Clark | #25646 | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tooth picks | |||
| Water purification sysytem | Merck | Elix Essential 10 UV | |
| Water urification sysytem | Merck | Milli-Q Synthesis A10 | |
| Weighing balance | METTLER | TOREDO | |
| Wild type C. elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center |
References
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
- Witvliet, D., et al. Connectomes across development reveal principles of brain maturation. Nature. 596, 257-261 (2021).
- Hedgecock, E. M., Russell, R. L. Normal and mutant thermotaxis in the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (10), 4061-4065 (1975).
- Mohri, A., et al. Genetic control of temperature preference in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 169 (3), 1437-1450 (2005).
- Wen, J. Y. M., et al. Mutations that prevent associative learning in C. elegans. Behavioral Neuroscience. 111 (2), 354-368 (1997).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Biology. 204 (10), 1757-1764 (2001).
- Tomioka, M., et al. The insulin/PI3-kinase pathway regulates salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. Neuron. 51 (5), 613-625 (2006).
- Torayama, I., Ishihara, T., Katsura, I. Caenorhabditis elegans integrates the signals of butanone and food to enhance chemotaxis to butanone. Journal of Neuroscience. 27 (4), 741-750 (2007).
- Kaufman, A. L., Ashraf, J. M., Corces-Zimmerman, M. R., Landis, J. N., Murphy, C. T. Insulin signaling and dietary restriction differentially influence the decline of learning and memory with age. PLoS Biology. 8 (5), 1000372 (2010).
- Stein, G. M., Murphy, C. T. C. elegans positive olfactory associative memory is a molecularly conserved behavioral paradigm. Neurobiology of Learning and Memory. 115, 86-94 (2014).
- Rahmani, A., Chew, Y. L. Investigating the molecular mechanisms of learning and memory using Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 159 (3), 417-451 (2021).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook. 25, 1-29 (2006).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3184-3191 (2005).
- Cho, C. E., Brueggemann, C., L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Parallel encoding of sensory history and behavioral preference during Caenorhabditis elegans olfactory learning. eLife. 5, 14000 (2016).
- Juang, B. T., et al. Endogenous nuclear RNAi mediates behavioral adaptation to odor. Cell. 154 (5), 1010-1022 (2013).
- Neal, S. J., et al. Feeding state-dependent regulation of developmental plasticity via CaMKI and neuroendocrine signaling. eLife. 4, 10110 (2015).
- Castellucci, V. F., Kandel, E. R. A quantal analysis of the synaptic depression underlying habituation of the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (12), 5004-5008 (1974).
- Klein, M., Kandel, E. R. Mechanism of calcium current modulation underlying presynaptic facilitation and behavioral sensitization in Aplysia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (11), 6912-6916 (1980).
- Amano, H., Maruyama, I. N. Aversive olfactory learning and associative long-term memory in Caenorhabditis elegans. Learning & Memory. 18 (10), 654-665 (2011).
- Nishijima, S., Maruyama, I. N. Appetitive olfactory learning and long-term associative memory in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 11, 80 (2017).
- Morrison, G. E., Wen, J. Y. M., Runciman, S., vander Kooy, D. Olfactory associative learning in Caenorhabditis elegans is impaired in lrn-1 and lrn-2 mutants. Behavioral Neuroscience. 113 (2), 358-367 (1999).
- Morrison, G. E., vander Kooy, D. A mutation in the AMPA-type glutamate receptor, glr-1, blocks olfactory associative and nonassociative learning in Caenorhabditis elegans. Behavioral Neuroscience. 115 (3), 640-649 (2001).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Sambongi, Y., et al. Caenorhabditis elegans senses protons through amphid chemosensory neurons: Proton signals elicit avoidance behavior. Neuroreport. 11 (10), 2229-2232 (2000).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Brockie, P. J., Madsen, D. M., Zheng, Y., Mellem, J., Maricq, A. V. Differential expression of glutamate receptor subunits in the nervous system of Caenorhabditis elegans and their regulation by the homeodomain protein UNC-42. Journal of Neuroscience. 21 (5), 1510-1522 (2001).
- Brockie, P. J., Mellem, J. E., Hills, T., Madsen, D. M., Maricq, A. V. The C. elegans glutamate receptor subunit NMR-1 is required for slow NMDA-activated currents that regulate reversal frequency during locomotion. Neuron. 31 (4), 617-630 (2001).
- Gustafsson, B., Wingstrom, H. Physiological mechanisms underlying long-term potentiation. Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).
- Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus. Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).
- Bliss, T. V. P., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Bailey, C. H., Giustetto, M., Huang, Y. Y., Hawkins, R. D., Kandel, E. R. Is heterosynaptic modulation essential for stabilizing Hebbian plasticity and memory. Nature Reviews Neuroscience. 1 (1), 11-20 (2000).
- Miyashita, T., et al. Mg2+ block of Drosophila NMDA receptors is required for long-term memory formation and CREB-dependent gene expression. Neuron. 74 (5), 887-898 (2012).
