カエノラブディティス・エレガンスにおける2つの化学物質のペアリングによる嫌悪的連想学習と記憶形成

1. レシピ NGM寒天プレート(ステップ2.1)6 cm NGMプレートを調製するには、2.5 gのペプトン、3 gのNaCl、および17 gの寒天を850 mLの二重脱イオンH 2 O(ddH2O)に溶解します。ddH2Oで総容量を972 mLにします。 オートクレーブ後、~65°Cまで冷却し、エタノールに溶解した5 mg/mLコレステロール1 mL、1 M CaCl2 および1 M MgSO4各1 mL、および1 Mリン酸カリウム(pH 6.0)25 mLを加えます。よく混合した後、直径6 cmのペトリ皿にそれぞれ8 mLを分注します。 蓋付きのプレートを室温(RT)のベンチに1日間保管し、使用するまで冷蔵室のプラスチック製品に保管してください。 10 gのトリプトン、5 gの酵母エキス、および10 gのNaClを1 LのddH 2 Oに溶解して、Luria-Bertani(LB)培地を調製し(ステップ2.1.)、5 N NaOH(数滴)でpHを7.0に調整し、オートクレーブ滅菌します。LB培地に15 gの寒天を加えてLBプレートを調製します。オートクレーブ後、~60°Cまで冷却し、直径9cmのペトリ皿に12mLずつ分注します。プレートは、使用するまで冷蔵室のプラスチック製品に保管してください。 動物コレクターを作るには(ステップ2.4)、透明なアクリル円筒パイプ(長さ3.5 cm、外径3 cm、壁厚2 mm)の底にナイロンメッシュ(30 μmメッシュサイズ)を接着剤で取り付けます。 0.25%ゼラチン水溶液を作るには(ステップ2.4)、0.25gのゼラチンを100mLのddH2Oに溶解し、オートクレーブ滅菌する。 走化性アッセイプレート(ステップ5.1。走化性アッセイ用の寒天プレートを作製するには、15 gの寒天をオートクレーブ滅菌により993 mLのddH2Oに溶解し、溶液を~65°Cに冷却します。 次に、オートクレーブ滅菌した1 M リン酸カリウム(pH 6.0)5 mL、1 M CaCl2 1 mL、および1 M MgSO4 1 mLを寒天溶液に加えます。これらの溶液はすべてオートクレーブ滅菌によって別々に滅菌されます。 混合溶液10 mLを6 cmのシャーレに分注します。蓋付きのプレートをRTのベンチに2日間置き、使用するまでRTのプラスチック製品で濡れたペーパータオルの上に置きます。これらのプレートは最大10日間使用できます。 走化性アッセイバッファーを作製するには(ステップ5.4)、5 mLの1 Mリン酸カリウム(pH 6.0)、1 mLの1 M CaCl 2、1 mLの1 M MgSO4、および993 mLのddH2Oを混合し、オートクレーブ滅菌によってこれらすべての溶液を別々に滅菌します。 40 mL CS/US混合溶液(1%水性1-プロパノールおよびHCl [pH 4.0])を作るには(ステップ3.1およびステップ4.1)、0.4 mLの絶対1-プロパノールと4 μLの5 M HCl(最終濃度で0.1 mM)を39.6 mLのddH2Oに加えます。 ddH 2 Oを作るには、浄水システムで水道水を2倍処理します( 材料表を参照)。 新鮮なコロニーにつまようじを10 mLのLB培地に接種し、37°Cで7〜8時間インキュベートすることにより、大腸菌OP50の液体培養物(OD600 = ~0.7)を準備します。長期間培養された細菌は、おそらく二次代謝産物のために、コンディショニングの結果に影響を与える可能性があります。 2.同期Cの準備。 エレガンス 標準的な方法26を用いて、6cmNGMプレート上で動物を培養する(ステップ1.1。NGMプレートは、0.2 mLの 大腸菌 OP50液体培養物をLB培地に広げ(ステップ1.9を参照)、RTで24時間以内インキュベートすることによって調製されます(古い細菌はコンディショニングの結果に影響を与える可能性があります)。注: C.エレガンスの 学習と記憶は、機械的、化学的、および温度のストレスに非常に敏感です。したがって、動物を培養し、水を含むすべての試薬を維持し、すべてのアッセイを17°C〜20°CのRTで実行することを強くお勧めします。 ボルテックス、ラフピペッティング、遠心分離などの物理的および機械的刺激は避ける必要があります。新鮮な1-プロパノールは、未知の理由で最長で3ヶ月ごとに使用する必要があります。重要なことに、飢餓はコンディショニングの結果に深刻な影響を与える可能性があるため、動物は十分な食物で栽培する必要があります。 1日目に、十分に給餌された5匹の妊娠動物を選び(ゆっくりと産卵する変異動物を4匹の6 cm NGMプレートのそれぞれに白金ワームピッカーで置き、RTで3時間~50個の卵を産ませて、成体動物の同期集団を取得します。プラチナワームピッカーでプレートから親動物を取り除くことによって産卵を停止します。注:動物へのストレスを最小限に抑えるために、播種したプレートはRTに保つ必要があります。 RTで動物を約5日間培養しますが、これは動物が若年成人期ではなく成熟した成体段階に達するのにかかる時間です。注:若い成体動物は成熟した成体動物よりもコンディショニングに使用される化学物質に敏感であるため、4.5日から5.5日までの培養期間は条件に応じて調整する必要があります(補足図1)。コンディショニング後、若い成体動物はより低い走化性指数(CI)値を示す可能性があります。. 動物コレクターに~200匹の成体動物を集め(ステップ1.4を参照)、各プレートを1 mLの0.25%水性ゼラチンで洗浄します(ステップ1.4)。この水性ゼラチンは、ピペットチップなどのプラスチックの表面への動物の付着を防ぎます。 コレクター内の動物をddH 2 Oで洗浄し(ステップ1.8.)、~10 mLのddH 2 Oでコレクターを2倍に軽く上下に動かします。 細菌汚染を防ぐために、このプロセスを~10 mLのddH 2 Oでさらに2倍(合計3倍)繰り返します。注:細菌汚染は動物の走化性に深刻な影響を及ぼします。 3.短期連想学習と記憶のためのマストレーニング 注: 一括トレーニングのワークフローについては、 図 1 を参照してください。 ~200匹の動物を含む動物コレクターを、1%1-プロパノールとHClの混合物40 mL(1-プロパノールと混合した後のpH 4.0、ステップ1.7を参照)に~1秒間結晶化皿に静かに浸します。注:対照動物についても同じことを行いますが、1%水性1-プロパノールにのみ浸します。HCl(pH 4.0)の動物を別の対照としてのみ治療する方が良いでしょう。 コレクター1xを6ウェル組織培養プレートのウェル内の10mLのddH2Oに非常に穏やかに浸漬することにより、コレクター内の動物を洗浄する。注意: この洗浄ステップは非常に穏やかでなければならず、長時間の洗浄は学習を妨げる可能性があるため、1回だけ実行する必要があります。 手順 3.1 を繰り返します。および3.2。中断なしで10倍(トライアル間隔[ITI]、0分)。注意: RTでは毎回新しいddH2Oを使用してください。 動物を休ませるために、コレクターを6 cm NGMプレートの上の 大腸菌 OP50芝生にRTで10分間置きます。 コレクター内の動物をddH 2 Oで洗浄し、コレクターを~10 mLのddH2Oで2倍に軽く上下に動かします。 細菌汚染を防ぐために、このプロセスをそれぞれ~10 mLのddH 2 Oでさらに2倍(合計3倍)繰り返します。 以下に説明するように走化性アッセイに進む(ステップ5)。 4.長期連想学習と記憶のための間隔トレーニング 注: 間隔を空けたトレーニング ワークフローについては、 図 2 を参照してください。 ~200匹の動物を含む動物コレクターを、1%1-プロパノールとHClの混合物40 mL(1-プロパノールと混合した後のpH 4.0、ステップ1.7を参照)に~1.0秒間結晶化皿に静かに浸します。注:対照としてのみ1%水性1-プロパノールで同じことを行います。HCl(pH 4.0)の動物を別の対照としてのみ治療する方が良いでしょう。 コレクター1xを6ウェル組織培養プレートのウェル中の10mLのddH2Oに非常に短時間浸漬することにより、コレクター内の動物を洗浄する。注意: 長時間の洗浄は学習を妨げる可能性があるため、この洗浄は非常に短くする必要があります。 動物を休ませるために、直径6 cm(直径)のペトリ皿のNGM寒天プレート上の 大腸菌 OP50芝生にコレクターをRTで10分間置きます。注:ITIは、動物がLTMの形成のために記憶を統合するために重要であるため、これを10分間休ませます。 手順 4.1.-4.3 を繰り返します。10倍。 RTに保たれている~10mLのddH 2 Oでコレクターを2倍にゆっくりと上下に動かして、コレクター内の動物をddH 2 Oで洗います。 細菌汚染を防ぐために、このプロセスをそれぞれ~10 mLのddH 2 Oでさらに2倍(合計3倍)繰り返します。 後述する走化性アッセイに進む(ステップ5。 5.走化性アッセイ 走化性アッセイ用の寒天プレートを6 cmのプラスチック製ペトリ皿に調製します(ステップ1.5を参照)。 プラスチック製のペトリ皿蓋の平らな面に置かれたコレクター内の動物(ステップ2.5)を、>1 mm(内径)の開口部を有する切断ピペットチップを使用して、1mLの0.25%水性ゼラチンを含む2 mLの微量遠心チューブに移します。注:動物へのせん断応力を最小限に抑えるために、切断されたピペットチップを使用することが重要です。 動物が重力によってチューブの底に~1分間落ち着いた後、チューブから上清を取り除きます(遠心分離しないでください)。 動物を1 mLの走化性アッセイバッファーに静かに再懸濁し(ステップ1.6を参照)、重力によってチューブの底に~1分間落ち着かせます(遠心分離しないでください)。ピペッティングでできるだけ多くの上清を取り除きます。 その間、図3Aに示すように、2箇所に5%水性1-プロパノールの各々4μLを斜めにスポットし、他の2箇所にddH2Oを各々4μLスポットした。1-プロパノールに対する感受性が低い変異体の走化性アッセイでは、補足表1に示すように、ナイーブ変異体の走化性指数(C.I.)値が~0.6になる高濃度の1-プロパノール水溶液を見つけます。注意: スポッティング手順をできるだけ早く完了することが重要です。スポット5%水性1-プロパノールは1%水性1-プロパノールが弱すぎて走化性アッセイにおいて動物を引き付けることができないからである。対照的に、1%よりも高濃度の水性1−プロパノールで処置された動物はより低いCI値を示すので、コンディショニングに1%水性1−プロパノールを使用する。 ~1.0 mm(内径)の開口部を有する切断ピペットチップを使用して、走化性アッセイ用の3つのプレートの中央に、~60匹の動物を含む走化性アッセイバッファー(ステップ5.4.4.)中の動物懸濁液の6 μL部分を見つけます。動物に触れずに実験用ティッシュ芯でできるだけ液体を取り除き、プレートに蓋をします。メモ: これらの手順は、できるだけ早く完了することが重要です。 動物をRTで10分間プレート上を自由に動かし、次にプレートを氷上のガラスペトリ皿に3分間移して走化性を停止させます。次に、プレート上の動物の数を数えるまで、プレートを冷蔵庫に保管します。 実体顕微鏡下で、中央の円の動物を除く4つのセクションの動物の数を数え、 図3Bに示す式を使用して走化性指数(C.I.)を計算します。C.I.値から、参照動物のC.I.値と馴化動物のC.I.値の差として学習指標(L.I.)値を計算します(L.I.=C.I.参照-C.I.コンディショニング)。注:参照動物のC.I.値(C.I.参照)は、1%水性1-プロパノールのみでコンフィグレーションされた動物のC.I.値の平均値です。.