腫瘍スフェロイドの半ハイスループット分析のための迅速な光学的クリアリング

このプロトコールは、1つの24ウェルプレート(約240〜360個のスフェロイドまたは10〜15個のスフェロイド/ウェル)を、ウェルあたり200μLのアガロースゲルおよびウェルあたり500μLの透明化溶液でマウントするのに十分な量の腫瘍スフェロイドの調製を記載している。完全な手順を 図 1 に示します。 1. 2%アガロース-PBSゲル調製 ガラス瓶に0.5gの低融点アガロース( 材料表を参照)を計量し、25mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加える。 アガロースを溶かし、溶液を電子レンジで30〜60秒間沸騰させ、蓋は閉じたが密閉せず、一定の渦巻きを伴わない。アガロースが完全に溶解し、溶液が沸騰しないことを確認します。注:ゲルは室温で保存することができます。蒸発を説明するために使用前に容量を確認してください。液体の状態(マイクロ波、渦巻き状態で20-60秒)にしてから使用してください。 2. 清澄化液の調製 N,N,N’,N’-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン9g、尿素22g、スクロース44g、トリトンX-1000000000g、脱イオン水24.9gを計量する(材料表参照)。注:N,N,N’,N’-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンのおおよその量を計量し、所望の濃度を得るために他の成分の重量を調整する方が簡単です。 溶液を56°Cの水浴中で一定の混合で加熱し、すべての結晶が溶解するまで続けます。 混合中に形成された気泡が表面に上昇することができるように、溶液を室温で休ませる。この溶液は、室温で最大2ヶ月間安定である。 3. 回転楕円体調製 前述のようにアガロースオーバーレイ法を用いてスフェロイドを生成する 1,3,14.注: 他の方法で生成された回転楕円体も、このイメージング プロトコルと互換性があります。 メスを使用して1mLのピペットチップの先端を切断し、オリフィスを拡大します。注:すべてのスフェロイドは、カットチップを備えた1 mLまたは200 μLのピペットで処理しました。 ピペットを使用して、ウェルから回転楕円体を吸引し、透明な1.5mL円錐管に移す。同じ条件の複数の回転楕円体を同じチューブ内で組み合わせることができます。注:常に回転楕円体がチューブの底に沈み込み、媒体を吸引するようにしてください。 スフェロイドを1mL PBSで2回洗浄し、中性4%予熱パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を加え、スフェロイドを37°Cで20分間インキュベートする。 PFA溶液を除去し、1mLのPBSでスフェロイドを2回洗浄する。 4. 回転楕円体染色 ピペットを使用して、最大 15 個のスフェロイドを 200 μL PCR チューブに移します。注: 壊れやすいスフェロイドの場合は、先に進む前にスフェロイドをゲルにマウントしてください (手順 5.1 ~ 5.4)。 PBS中の0.5%Triton X-100の200μLを用いて細胞を透過除去する。PCR チューブを 50 mL スクリューキャップチューブ内に置き、スフェロイドを室温で軽度の攪拌で 2 時間インキュベートします。注:特に指定のない限り、すべてのインキュベーションは、ローター、ローラー、またはシェーカー( 材料表を参照)での攪拌で行われます。これは、均一な染色を達成するために重要である。PBS内の固定スフェロイドは、ピペットチップの側面にくっつくことがあります。先端を0.5%Triton X-100ですすぐと、回転楕円体が先端に付着するのを最小限に抑えます。 溶液(ステップ4.2)を200μLの抗体希釈バッファー(ABDIL)15 に交換し、室温で一晩インキュベートします。 ABDILを除去し、ABDILに75 μLの一次抗体を加え、4°Cで2.5日間インキュベートした。 上清を除去し、0.1% Tween および 0.1% Triton X-100 (PBS-TT) を含む 200 μL の PBS で 2 回洗浄し、200 μL の PBS-TT と共に室温で 4 時間インキュベートします。 PBS-TTを除去し、ABDILに100 μLの二次抗体を加え、4°Cで2.5日間インキュベートした。注:DAPIまたは他の核色素は、この段階で添加することができる。ほとんどの色素は、抗体よりもインキュベーション時間が少なくて済みます。 上清を除去し、200 μL の PBS-TT で 2 回洗浄し、200 μL の PBS-TT で 4 時間インキュベートします。回転楕円体は取り付けの準備ができています。 5. 取り付け 200 μL のピペットを使用して、固定および染色したスフェロイドを、条件ごとに 1 本のチューブ (約 10 ~ 15 個のスフェロイド) で 500 μL PCR チューブに移します。 溶液を200 μLの2%(w/v)液体アガロースゲルと交換し、室温で30秒間、クイックスピン(固定された最高速度で、 材料表を参照)で遠心分離します。メモ: すぐに取り付ける場合を除き、ゲル硬化を避けるために 50 °C の加熱ブロックに入れてください。 スフェロイドを約50 μLの液体アガロースゲルで吸引し、24ウェルガラス底プレートのウェルに分注します。 ゲルが固まる前に、周囲のゲルのピペットチップを使用してスフェロイドを分離し、スフェロイドがゲルで覆われていることを確認します。任意選択で、プレートを氷の上に置き、ゲルを急速にセットする。注: ウェルあたりの回転楕円体の数は、回転楕円体のサイズによって異なります。回転楕円体は互いに遠くに配置され、イメージング中に1つの回転楕円体のみが視野に入るようにします。これは、自動画像処理にとって重要です。 1ウェルあたり500μLの清澄溶液(ステップ2)を加え、ゲルが水没していることを確認する。RTで少なくとも24時間インキュベートし、クリアリング溶液中の回転楕円体をイメージングします。スフェロイドは、室温で最大1ヶ月間、蒸発から保護されている場合、この溶液中で安定である。 6. イメージング 容器内の回転楕円体の取り付け高さを含む、回転楕円体全体を包括するのに十分な長さの作動距離を持つ対物レンズを選択します。注: 回転楕円体の赤道面をイメージするには、作動距離が 3 mm 以上の対物レンズが必要です。NAが高く、倍率の高い対物レンズは、より良い解像度を可能にすることができるが、回転楕円体を画像化できる最大深さを制限する。 赤道面を識別するには、XY平面で最大の表面積に達するまで焦点を調整し、必要なレーザー出力の割合、検出器電圧、ゲイン、オフセット設定で画像を作成します。メモ:レーザー出力の割合、検出器の電圧、ゲイン、オフセットは、蛍光色素分子、染色強度、レーザー強度、検出器の感度などによって大きく異なります。 3D 画像の場合は、回転楕円体の開始と終了を設定し、イメージング前に z 強度補正設定を使用して、さまざまな Z 深度で適切な信号強度を選択します。メモ: 最適な画像解像度を得るには、x、y、z にナイキストサンプリングレートを使用します(詳細については、リファレンス16 を参照してください)。