ניקוי אופטי מהיר לניתוח בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול
Summary
ספרואידים של גידולים הופכים להיות מנוצלים יותר ויותר כדי להעריך אינטראקציות בין תאים למיקרו-סביבה של הגידול ואת התגובה לטיפול. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חזקה אך פשוטה להדמיה בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול תלת-ממדיות באמצעות ניקוי אופטי מהיר.
Abstract
ספרואידים של גידולים הופכים במהירות לדבר שבשגרה בחקר הסרטן הבסיסי ובפיתוח תרופות. קבלת נתונים לגבי ביטוי חלבונים בתוך הספרואיד ברמה התאית חשובה לניתוח, אך הטכניקות הקיימות הן לעתים קרובות יקרות, מייגעות, משתמשות בציוד לא סטנדרטי, גורמות לעיוות גודל משמעותי, או מוגבלות לספרואידים קטנים יחסית. פרוטוקול זה מציג שיטה חדשה להרכבה וניקוי של כדוריות המטפלות בבעיות אלה תוך מתן אפשרות לניתוח קונפוקלי של המבנה הפנימי של הספרואידים. בניגוד לגישות הקיימות, פרוטוקול זה מספק הרכבה מהירה וניקוי של מספר רב של ספרואידים באמצעות ציוד סטנדרטי ואספקת מעבדה. הרכבה של כדוריות בתמיסת ג’ל agarose-PBS ניטרלית pH לפני הצגת תמיסת סליקה המותאמת למקדם שבירה, ממזערת עיוות גודל המשותף לטכניקות דומות אחרות. זה מאפשר ניתוח כמותי וסטטיסטי מפורט שבו הדיוק של מדידות גודל הוא בעל חשיבות עליונה. יתר על כן, בהשוואה לתמיסות ניקוי נוזלי, טכניקת הג’ל האגרוז שומרת על כדוריות קבועות במקומן, ומאפשרת איסוף של תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות). המאמר הנוכחי מפרט כיצד השיטה מניבה תמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות באיכות גבוהה המספקות מידע על השתנות בין תאים ומבנה ספרואידי פנימי.
Introduction
תרביות תאים תלת-ממדיות (3D), כגון ספרואידים, מספקות מודלים מציאותיים מבחינה ביולוגית וניתנים לשחזור של צמיחת תאים מצטברת 1,2. מודלים אלה הופכים במהרה לדבר שבשגרה הן במחקר בסיסי והן בפיתוח תרופות, שם נבחנים הבדלים בגודל ובמבנה הספרואידים בין הטיפולים כדי לוודא את יעילות התרופה 3,4. בהקשרים אלה, היכולת לאסוף מידע מפורט ממספר רב של כדוריים היא בעלת יתרון רב, הן מנקודת מבט של כוח סטטיסטי והן כדי לאפשר הערכה מהירה של התנהגות התאים על פני מספר טיפולים.
טכניקות נפוצות לקבלת תמונות מיקרוסקופיה מפורטות של מבנה ספרואידי גוזלות זמן רב, יקרות, או מפיקות תמונות באיכות ירודה שאינן שומרות על תכונות כמותיות מרכזיות כגון גודל ספרואיד 4,5. לדוגמה, טכניקות היסטולוגיות המבוססות על cryosectioning יכולות לספק תמונות באיכות גבוהה אך לעתים קרובות הן גוזלות זמן רב, דורשות עבודה מיומנת, ולעתים קרובות יוצרות חפצי חתך 6,7, בעוד שטכנולוגיות אלגנטיות, כגון מיקרוסקופ תאורה במישור יחיד (SPIM)8 ומיקרוסקופיה מרובת פוטון9 דורשות מיקרוסקופים מיוחדים שאינם זמינים בקלות. טכנולוגיות מיקרוסקופיה מודרניות אפשרו לאחרונה את מה שמכונה חתך אופטי, שבו הספרואידים ממוקמים בתוך תמיסת סליקה מותאמת למקדם שבירה ותמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית 4,5. בעוד שלטכניקות אלה יש פוטנציאל לייצר תפוקה גבוהה, בעיות נפוצות כוללות תנועה כדורית תוך כדי הדמיה, עיוות גודל בזמן ניקוי, וההוצאה הגבוהה של פתרונות סליקה קנייניים. יתר על כן, פרוטוקולים קיימים רבים חלים רק על ספרואידים קטנים יחסית בקוטר או בעומק של פחות מ-300 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר, ומגבילים את הטכנולוגיה לשלבים המוקדמים של צמיחת הגידול 5,10,11.
הפרוטוקול הנוכחי מאפשר איסוף בתפוקה גבוהה למחצה ובעלת תפוקה גבוהה של תמונות ספרואידיות מפורטות באמצעות תמיסת סליקה תואמת מקדם שבירה בעלות נמוכה הנגזרת מהליכי ניקוי איברים שלמים12,13. כדי למנוע תנועה כדורית במהלך ההדמיה ולספק תמיכה מבנית להפחתת עיוותי גודל, הספרואידים מותקנים בג’ל agarose-PBS בצלחת תחתונה מזכוכית #1.5 בעלת 24 בארות. מכיוון שטכניקה זו מאפשרת להרכיב מספר כדוריות בכל באר בצלחת של 24 בארות, ניתן להרכיב במהירות עד 360 ספרואידים (15 ספרואידים/באר) ולדמות אותם בתנאי ניסוי שונים. תמיסת סליקה תואמת-מדד שבירה הבנויה מחומרים מתכלים זמינים בקלות משמשת לפינוי כדוריות המותקנות ועל הג’ל שמסביב באופן אופטי. לאחר תקופת התיישבות של 24 שעות, פרוטוקול זה מספק תמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות באיכות גבוהה של מבנה ספרואידי, אפילו עבור ספרואידים גדולים יחסית (בקוטר של כ-700 מיקרומטר), עם עיוות בגודל של פחות מ-2%.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול לקבלת תמונות דו ותלת מימדיות באיכות גבוהה של כדוריות גידול מוצג כאן. שיטות קיימות, כגון CLARITY, See Deep Brain (SeeDB) ו-ScaleS, גורמות לעיתים קרובות לעיוות גודל בשיעור של עד 30%, בעוד שטכניקות כגון בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט (BABB) והדמיה תלת-ממדית של איברים המנוקים מממסים (3DISCO) יכולות להרוות חלבון פלואורסצנטי18. רבות משיטות אלה מיועדות לניקוי רקמות עם שלמות מבנית ומעוותות את הגודל והמבנה כאשר הן מיושמות על ספרואידים18. בניגוד לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בפתרונות סליקה יקרים הזמינים מסחרית, פרוטוקול זה משתמש בחומרים מתכלים זמינים בקלות תוך שמירה על בהירות אופטית ופלואורסצנציה אנדוגנית ומזעור עיוותי גודל. הטמעת כדוריות בג’ל אגרוז-PBS מספקת תמיכה מבנית לספרואידים וממזערת הלם אוסמוטי כאשר מוסיפים את פתרון הניקוי. זה חיוני כאשר הדמיה של כדוריות שבריריות לאחר טיפול תרופתי. ההנחה היא ששיטת סליקה אופטית זו מתאימה לספרואידים הנוצרים בכל שיטה שכן פרוטוקול זה מותאם מניקוי רקמות שלמות. ההנחה מבוססת על הדמיון בספרואידים המתקבלים על ידי שיטות שונות להיווצרות ספרואידים. הבחירה בקיבוע יכולה להשפיע על גודל הכדורית כמו גם על פלואורסצנציה אנדוגנית. שיטת סליקה זו מתאימה לספרואידים הקבועים בתמיסת PFA ניטרלית של 4%. בדיקה נוספת נדרשת כדי לבדוק את תאימותו עם מקבעים אחרים.
בהתחשב בכך שטכניקה זו מאפשרת להרכיב מספר כדוריות בו זמנית בלוח מרובה בארות, היא מתאימה היטב לצינורות אנליזה כמותיים הדורשים מידע מבנה ספרואידי מעד 360 ספרואידים לכל צלחת של 24 בארות. מיקרוסקופים עם פונקציות אוטומטיות של מיפוי שלבים ולוחות יכולים להפוך את ההדמיה לפחות ידנית. למרות ששיטה זו מהירה וקלה יותר מחתך, היא כרגע אינה מתאימה לאוטומציה מלאה. עם זאת, תמונות המתקבלות בשיטה זו מתאימות לעיבוד תמונה אוטומטי 4,19, והקצב שבו ניתן להרכיב ספרואידים באמצעות פרוטוקול זה מתאים לניתוח כמותי של מבנה פנימי ספרואידי 20,21,22.
כדי להכתים ספרואידים שלמים, יש להתאים את ריכוז הנוגדנים, נפחם וזמן הדגירה לכל נוגדן. כמדריך, השתמש פי 2.5 מריכוז הנוגדנים הדו-ממדיים המומלץ של נוגדנים אימונופלואורסצנטיים ו-100-200 μL של נוגדנים, בהתאם למספר הספרואידים לכל צינור. ודא שכל הספרואידים מכוסים בתמיסת צביעה כאשר הם על הרוטור. זמן הדגירה תלוי בגורמים רבים, כולל גודל וצפיפות הספרואידים והנוגדן, ויכול לנוע בין 16-72 שעות. למרות השיטה המאפשרת זיהוי אותות עמוק יותר בתוך הספרואיד, פלואורופורים המתלהבים מ-UV גורמים לפיזור אור משמעותי, מה שמוביל ליחס אות לרעש נמוך. יש לנקוט בזהירות בעת בחירת פלואורופורים כדי לדמיין את חלבון המטרה. לדוגמה, צביעת חלבונים פחות שופעים ומבניים עם פלואורופורים באורך גל ארוך יותר וכתמי חלבון או גרעין שופעים יותר עם פלואורופורים באורך גל קצר יותר תשיג את התוצאה הטובה ביותר. לבסוף, ספרואידים מנוקים עדיין מראים אובדן אור עקב פיזור בליבה הנמקית, הניכר בממד y/z של תמונות המתקבלות של 600 מיקרומטר כדוריות (איור 2C).
הדמיית הגדלה גבוהה יותר עם מטרות NA גבוהות יותר אפשרית עם ספרואידים המותקנים ומנוקים באמצעות פרוטוקול זה, אך מרחק העבודה של המטרה מגביל את עומק ההדמיה. עבור עדשת טבילת שמן, חשוב להשתמש בשמן בעל RI של 1.51 לקבלת התוצאה הטובה ביותר.
לסיכום, שיטת הסליקה המוטבעת של ג’ל agarose-PBS מאפשרת הדמיה של תאים עמוק בתוך הספרואידים באמצעות חומרים מתכלים נפוצים הזמינים. ספרואידים המותקנים ומנוקים בשיטה זו עוברים עיוות גודל מינימלי ושומרים על שלמותם המבנית, ומאפשרים איסוף של נתונים באיכות גבוהה הנוגעים למבנה הספרואידי הפנימי ולכימות אוטומטי לאחר מכן.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה בוצע במכון המחקר התרגומי (TRI), וולונגאבה, QLD. TRI נתמך על ידי מענק מממשלת אוסטרליה. אנו מודים לצוות במתקן הליבה של המיקרוסקופיה ב- TRI על התמיכה הטכנית יוצאת הדופן שלהם. אנו מודים לפרופ’ אטושי מיוואקי, RIKEN, וואקו-סיטי, יפן, על שסיפקו את מבני FUCCI, לפרופ’ מנהרד הרלין ולגב’ פטרישיה ברפורד, מכון Wistar, פילדלפיה, פנסילבניה, על אספקת קווי התאים. אנו מודים לד”ר לורדנה ספוררי על שסיפקה תמונות קריו-אקטציה C8161.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי פרויקט ל- N.K.H.: מועצת המחקר האוסטרלית (DP200100177) ומענק פרויקט מיהאן (021174 2017002565).
Materials
| #1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
| 500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
| Deionized water | MILLI Q | ||
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
| DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
| Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
| Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
| Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
| Microwave | Sharp | ||
| N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
| NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
| NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
| p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
| Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
| Pipette | Eppendorf | ||
| Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
| Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
| Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
| Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
| Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
| Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
| Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |
References
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2008).
- Spoerri, L., Gunasingh, G., Haass, N. K. Fluorescence-based quantitative and spatial analysis of tumour spheroids: A proposed tool to predict patient-specific therapy response. Frontiers in Digital Health. 3, 668390 (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 20 (2020).
- Kabadi, P. K., et al. Into the depths: Techniques for in vitro three-dimensional microtissue visualization. BioTechniques. 59 (5), 279-286 (2015).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
- Spoerri, L., et al. Phenotypic melanoma heterogeneity is regulated through cell-matrix interaction-dependent changes in tumor microarchitecture. bioRxiv. , (2021).
- Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment Cell & Melanoma Research. 27 (5), 764-776 (2014).
- Ahmad, A., et al. Clearing spheroids for 3D fluorescent microscopy: combining safe and soft chemicals with deep convolutional neural network. bioRxiv. , 428996 (2021).
- Villani, T., Rossi, A. E., Sherman, H. Image-based characterization of 3-D cell culture models grown in spheroid microplates. American Laboratory. 50 (6), 12 (2018).
- Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-time cell cycle imaging in a 3D cell culture model of melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Cold Spring Harbor. Antibody Dilution Buffer (Abdil). Cold Spring Harbor Protocols. , (2018).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 20-42 (2006).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Browning, A. P., Murphy, R. J. . Zenodo. , (2021).
- Browning, A. P., et al. Quantitative analysis of tumour spheroid structure. eLife. 10, 73020 (2021).
- Klowss, J. J., et al. A stochastic mathematical model of 4D tumour spheroids with real-time fluorescent cell cycle labelling. Journal of The Royal Society Interface. 19 (189), 20210903 (2022).
- Murphy, R. J., Browning, A. P., Gunasingh, G., Haass, N. K., Simpson, M. J. Designing and interpreting 4D tumour spheroid experiments. Communications Biology. 5 (1), 91 (2022).
