シトネム解析のための胚性マウス組織の固定

このプロトコルは、施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)およびセントジュード小児研究病院の承認された動物ケアガイドラインに準拠しています。全ての菌株は、C57BL/6J株に5世代を遡及した。 1. 胚単離と全マウント染色 6週齢の女性を繁殖させ、膣プラグの存在を監視する。 AVMAガイドライン18に従って、CO2チャンバー内のCO2吸入に続いて子宮頸部脱臼によって妊娠中のダムを安楽死させる。解剖ハサミと鉗子を使用して腹腔にY切開を行います。承認された機関ガイドラインに従って、E9.5胚を含む子宮を切除する。 完全な成長培地(非必須アミノ酸、ピルビン酸Na、L-グルタミン、および10%ウシ胎児血清を添加したダルベッコの改変イーグル培地)で胚を解剖する。鉗子を使用して、卵黄嚢、胎盤、および周囲の膜を除去します。注:必要に応じて、胚のジェノタイピングのために各卵黄嚢を保存してください。 ハンク平衡塩溶液(HBSS)で分離した胚をすすぎ、残存する羊膜組織および血液を除去します。 固定液を準備します。パラホルムアルデヒド(PFA)をHBSSに加え、最終作業濃度を4%PFAにします。警告: PFA は有毒な化学物質であるため、吸入や皮膚への直接暴露は避けてください。固定液の調製は、手袋および白衣の適切な個人用保護具を備えたヒュームフードの下で行われる。 24ウェルプレートの各ウェルに1mLの固定液を加え、各胚を個々のウェルに入れる。胚を固定液中で45分間インキュベートし、ロッカー上で穏やかに攪拌する。注:重大:すべての洗浄およびインキュベーションは、胚の突然の取り扱いまたは移動が固定サイトネムを破壊するため、ロッカーまたは円形シェーカー上で 穏やかな 攪拌(最大20RPM)で行わなければならない。ピペットを使用して、すべての溶液を静かに除去します。 固定液を取り出し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で胚をCa2+およびMg2+で3 x 30分間洗浄し、0.1%トリトンを加えた。 洗浄後、穏やかな攪拌でブロッキング溶液(Ca2+およびMg2+、0.1%トリトン、および5%ヤギ血清を含むPBS)中で胚をインキュベートする。ブロック 2 x 1 時間。第2のブロッキングインキュベーションの後、新鮮なブロッキング溶液を用いて胚の1回のクイックリンスを行う。 第2ブロッキング工程中に、一次抗体溶液11を調製する。PBS中の最適化された濃度に抗体をCa2+およびMg2+、0.1%Tween-20、および5%ヤギ血清で希釈する。注:膜GFPの可視化を強化するために、ニワトリ抗GFP(1:250)を使用することができます。 ブロッキング溶液を除去し、1mLの一次抗体溶液を各ウェルに加える。4°Cで緩やかな回転で3日間インキュベートする。 一次抗体インキュベーションに続いて、胚を 20 RPM で 20 RPM で 5 x 1 時間洗浄し、PBS 中のロッカー上でCa2+ および Mg 2+、0.1% Tween-20、および 5% ヤギ血清で洗浄します。 F(ab’)2フラグメント二次抗体溶液を、Ca2+およびMg2+、0.1%Tween-20、および5%ヤギ血清を含むPBS中で1:1,000希釈で調製する。注:F(ab’)2 フラグメントを使用すると、サンプルへの抗体の浸透が大幅に向上します。 1mLの二次抗体溶液を各ウェルに加える。暗所で4°Cで3日間穏やかに揺らしながらインキュベートする。注:重要:この時点から、直接光への胚曝露を最小限に抑えてください。オプション:細菌の増殖を防ぐために、0.2%アジ化ナトリウムを二次抗体溶液に加えます。 二次抗体溶液を除去し、胚をPBS中で3 x 30分間、Ca2+ およびMg2+、0.1%Tween-20、および5%ヤギ血清で洗浄する。ファロイジンまたは他のアクチン色素によるアクチン染色を行わない場合は、最初の洗浄後、4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をCa2+ およびMg2+、0.1%Tween-20、および5%ヤギ血清でPBSに加え、1時間インキュベートし、続いて上記のように3 x 30分間洗浄する。注:この時点で、胚は、翌日の包埋ステップまで、暗所でPBSまたはHBSS中で4°Cで一晩保存することができる。しかし、胚はすぐに埋め込まれて切片化されることをお勧めします。 2. 胚の埋め込み、切断、マウント Ca2+およびMg2+とともにHBSSまたはPBSに溶解した4%w/v低融点(LMP)アガロース溶液を、胚あたり約3mLの最終容量まで調製する。LMPアガロースが溶解するまで、Ca2+およびMg2+およびマイクロ波を用いて、HBSSまたはPBSにLMPアガロースの適切な重量を加える。注:LMPアガロースが溶解したら、LMPアガロース溶液が固化しないように、55°Cに設定したビーズバス、インキュベーター、またはウォーターバスに溶液を保管してください。 胚の埋め込み型として12ウェルプレートを使用してください。12ウェルプレートを55°Cのビーズ浴中に置く。胚を保持する各ウェルに2.5〜3mLの4%LMPアガロースを加える。注:他の金型を使用することもできますが、12ウェルプレート容量は、セクショニングのために後の段階でアガロースブロックを準備するのに最適です。 穿孔スプーンを用いて、4%LMPアガロース溶液を含む個々のウェルに胚を移す(図1A)。 12ウェルプレートをビーズバスからベンチトップに移します。ピペットチップを使用して、胚を穏やかに埋め込み、溶液の中央に収まるように向きを変えます。胚の向きが決まったら、プレートを-20°Cで10分間置き、ブロックを素早く固化させます。重大:胚がブロックの中央に配置されていることを確認します。底に沈んだり、型の端に近すぎたりする胚は、切断中にアガロースブロックから取り除かれる可能性があります。 メスを使用して井戸からアガロースブロック全体を取り出し、胚の周りに長方形のブロックを切断し、両側に〜0.3cmのブロックを残します。胚の尾端に沿って余分な長さを許可します。ビブラトームに装着するときは、胚をブロックの上部の直立位置に向ける(図1B)。 ビブラトームの標本ホルダーにテープのストリップを塗布し、アガロースブロックをテープにスーパーグルーピングし、ブレードが前部(頭蓋)から後部配列に胚の軸方向部分を生成するように配向させる。 ビブラトームチャンバーを冷たいHBSSで満たしてサンプルが完全に浸漬されていることを確認し、チャンバーを氷で囲みます。 ビブラトーム 速度 を 0.2 mm/s 、 周波数 を5~7(50~70 Hz)に設定し、 切断厚さ を 100 μmに設定します。胚の連続軸切片化を行う。メモ: セクショニングには低速を使用してください。切断速度が0.25mm/sを超えると、切片化によって胚が引き裂かれたり、胚がブロックから取り除かれたりすることがあります。 セクショニングシリーズ中は、鉗子を使用して個々のセクションをHBSSで満たされた別の60 mmディッシュに静かに移します。鉗子を使用して、組織ではなくブロックをつかみ、組織の損傷やサイトネムの破壊を避けます。注:組織切片はアガロースブロック内にとどまるべきである。組織がブロックからビブラトームチャンバーに落ちる場合は、切片を持ち上げて静かに移します。ティッシュをつかんだりつまんだりしないでください。重大:組織切片の折り畳みや突然の取り扱いは、組織切片内の固定サイトネムを破壊する。 F-アクチン染色を行わない場合は、ステップ2.10に進みます。 F-アクチン染色を行うには、HBSSを除去し、室温でCa 2+およびMg 2+、0.1% Tween-20、および5%ヤギ血清でPBSで希釈したアクチンレッドおよびDAPI溶液で切片を40分間インキュベートします。 PBSで切片を3 x 20分洗浄し、Ca2+ およびMg2+ および0.1%トゥイーン-20で洗浄する。 疎水性マーカーペンを使用して、荷電顕微鏡スライドの縁の周りに疎水性バリアを描き、少量のHBSSを追加して領域を埋めます。 鉗子または穴あきスプーンを使用して、セクションをスライドに移します。注:アガロースに包まれていない組織切片は、転写ピペット を介して 移すことができます。 鉗子を使用して余分なアガロースブロックを除去します。 すべてのセクションをスライドに移したら、ピペッティングと吸収性タオルレットの角 で 余分な液体を取り除き、スライドに数滴の取り付け媒体を追加します。硬化させるときは、カバースリップ領域全体を覆うのに十分な取り付け媒体を使用してください。カバースリップをスライドにそっと置いて取り付けます。メモ: 取り付け媒体が硬化するまで、圧力をかけたり、カバースリップを乱したりしないでください。 3. イメージング 任意の共焦点または高分解能顕微鏡11上で組織切片の画像化を行う。遺伝子型ごとに最低3つの胚を分析します。注:組織切片の画像は、TCS SP8 STED 3x共焦点顕微鏡を使用して取得し、続いてLIGHTNINGデコンボリューションを取得しました。