כאן, פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב מסופק לקיבוע, חיסון וחתך של עוברים כדי לזהות פילופודיה איתותית מיוחדת הנקראת ציטונמות ברקמות עכבר מתפתחות.
דפוס רקמה התפתחותית והומאוסטזיס של רקמות לאחר התפתחות תלויים בהעברה מבוקרת של אותות תאיים הנקראים מורפוגנס. מורפוגנים פועלים באופן תלוי ריכוז וזמן כדי לציין תוכניות שעתוק נפרדות המנחות ומחזקות את גורל התא. מנגנון אחד שבאמצעותו מובטחים ספי איתות מורפוגן מתאימים הוא באמצעות אספקת חלבוני האיתות על ידי פילופודיה מיוחדת הנקראת ציטונמות. ציטונמים הם דקים מאוד (בקוטר ≤200 ננומטר) ויכולים לגדול לאורכים של כמה מאות מיקרונים, מה שהופך את שימורם לניתוח תמונה קבועה למאתגר. מאמר זה מתאר שיטה מעודנת לטיפול עדין בעוברי עכברים לצורך קיבוע, חיסון וחתך עבה כדי לאפשר הדמיה של ציטונומים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי לדמיין ציטונים המחברים תאי איתות תאיים מובחנים במהלך פיתוח תעלה עצבית של עכבר. ניתן גם להתאים את הטכניקה לזיהוי ציטונמים על פני סוגי רקמות כדי להקל על חקירת איתות התפתחותי ברזולוציה חסרת תקדים.
ההתפתחות העוברית מתוזמרת באמצעות הפעלה מתואמת של מסלולי איתות מורפוגן. מורפוג’נים הם חלבונים קטנים ומופרשים המסווגים לקיפוד סוניק (SHH), מה שהופך את גורם הגדילה β (TGF-β)/חלבון מורפוגני עצם (BMP), אתר אינטגרציה ללא כנפיים (WNT) ומשפחות פיברובלסטים וגורמי גדילה אפידרמליים (FGF/EGF). מורפוגנים מיוצרים ומשתחררים ממרכזי התארגנות תאית במהלך התפתחות הרקמות ויוצרים שיפועי איתות על פני שדות מארגנים של תאים כדי ליידע את מורפוגנזה של רקמות 1,2,3,4,5. ייצוג אחד של גרדיאנטים של מורפוגן נמצא במערכת העצבים המתפתחת, שם מערכת העצבים המרכזית המשוערת מעוצבת באמצעות הפעלת מסלול מורפוגן. רקמה זו, המכונה הצינור העצבי, מורכבת משיפועים מנוגדים של SHH המופרשים על ידי הנוטוקורד הגחוני ביותר ולוח הרצפה, ו- WNTs / BMPs המופרשים מלוח הגג הגבי, כדי לעצב אזורי אב עצביים מובחנים6. הצינור העצבי משמש בדרך כלל לחקר שלמות השיפוע של מורפוגן במחקר התפתחותי.
היווצרות גרדיאנט מורפוגן מסתמכת על ויסות הדוק של פיזורהאותות 7. מנגנון תאי אחד שבאמצעותו זה מתרחש הוא באמצעות היווצרות של פילופודיה איתותית ארוכה הנקראת ציטונמות המאפשרות העברה ישירה של מורפוגנים מתאים המייצרים אותות לאוכלוסיות ספציפיות של תאי מטרה. ציטונמים נצפו מרחיבים מאות מיקרומטרים כדי להפקיד מורפוגנים על קרומי תאים קולטים אותות 8,9. שיבוש בהעברת מורפוגן בתיווך ציטונמה מוביל לאנומליות התפתחותיות הן בזבובים והן בבעלי חוליות, ומדגיש את חשיבותן במהלך דפוס הרקמות 10,11,12,13,14.
עד כה תועדו ציטונמים במודלים של דרוזופילה, אפרוחים ודגי זברה, אך הדמיה של המבנים בעוברי יונקים מתפתחים נותרה מאתגרת 8,9,15. מכשול להדמיה יעילה של ציטונמים ברקמות יונקים מורכבות באתרם הוא אופיים הדק והשברירי, מה שהופך אותם לרגישים לנזק בשיטות קיבוע קונבנציונליות8. בעבר פיתחנו ועשינו אופטימיזציה של פרוטוקולים למיקרוסקופיית אלקטרונים מתוקנת (MEM-fix) כדי לשמר ציטונים בתאים בתרבית ולאפשר את המחקר שלהם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית16,17.
השימוש בטכניקת MEM-fix אפשר זיהוי של חלק מהמולקולות המעורבות ביצירת ציטונמות המושרות על-ידי SHHותפקודן 11,16,17. עם זאת, אישור הממצאים הללו בהקשר הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית של דפוס הצינורות העצביים הצריך פיתוח של טכניקות חדשניות לתיקון ותמונה של רקמה עוברית של עכבר. כאן מתואר פרוטוקול לתיקון עוברי עכברים באופן שישמור על שלמות הציטונמה ויאפשר חיסון וחיתוך לאחר מכן של רקמה עוברית לצורך ניתוח קונפוקלי. פרוטוקול זה פותח באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק הקשור לממברנה (GFP) כדי לתייג הרחבות ממברנה מהתאים המייצרים SHH בתעלה העצבית המתפתחת. יישום פרוטוקול זה יעסוק בשאלות שלא נענו הנוגעות לשכיחותם ומשמעותם של ציטונמים בפיתוח מערכות יונקים.
פרוטוקול זה פותח לשימור ציטונמים עדינים בחתכי רקמות עובריות לצורך מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה. עד כה, הדמיה של ציטונמים ברקמות על פני אורגניזמים שונים במודלים שונים הסתמכה במידה רבה על ביטוי חוץ רחמי של חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי באמצעות הדמיה של רקמות חיות. למרבה הצער, השימוש בהדמיה חיה המסומנת באופן פלואורסצנטי תורם רק לעתים רחוקות לניתוח של חלבונים בעלי ביטוי אנדוגני, יכול להכניס אילוצי זמן ודורש שלבי הדמיה מיוחדים ומיקרוסקופים. שיטת ההכתמה והחתך המתוארת כאן משמרת ציטונמים והרחבות תאיות אחרות כדי לאפשר אימונוהיסטוכימיה לגילוי בסופו של דבר של חלבונים בעלי ביטוי אנדוגני. טכנולוגיה זו תאפשר תובנות חדשות על האופן שבו מורפוגנים מועברים על פני רקמות שונות in vivo ותרחיב את היקף מערכות המודל שבהן ניתן לחקור ציטונמות.
פרוטוקול זה משתמש בצביעה בהרכבה מלאה ובחתך עבה של ויברטום, אשר נמנע משימוש בתמיסת שיווי משקל כגון גליצרול או תמיסות מגן על ההקפאה כגון סוכרוז. מטרתו למזער את הטיפול ברקמות החתוכות כדי לאפשר שימור מקסימלי של הרחבות תאיות. טיפול מופחת ברקמה לאחר הניתוק סיפק באופן עקבי תוצאות טובות יותר בשימור הכולל של הציטונמות. לפיכך, חיתוך העובר הוא אחד השלבים האחרונים לפני ההדמיה.
MEM-fix, טכניקת קיבוע שפותחה לשימור ציטונמים של תאים בתרבית, מורכבת משילוב של גלוטארלדהיד ו-PFA המאפשר שימור תלת-ממדי משופר של ארכיטקטורת התא המולדת הדומה לממדים החיים שלהם16,17. למרבה הצער, MEM-fix לא היה שימושי לקיבוע עוברים מכיוון שגלוטרלדהיד יכול לבצע פלואורסציה אוטומטית ומגביל מאוד את חדירת הנוגדנים ואת קשירת האפיטופים בתאים עקב פעילות גבוהה של קישור צולב חלבוני22,23. לפיכך, פרוטוקולי חתך לאחר תנאי קיבוע PFA הותאמו כדי לאפשר שימור של הרחבות תאיות ברקמה עוברית. למרות ש-PFA יכול לשמר הרחבות דמויות ציטונמה ברקמה עוברית, יש לבצע ניתוח תמונה בזהירות. PFA יכול לגרום להתייבשות חלקית של תאים ורקמות בודדים, מה שמוביל להקטנת נפח קלה ולהיווצרות חללים חוץ-תאיים קטנים בתוך הרקמה הקבועה.
פרוטוקול זה מונע את השלבים הנוספים של resaturation סוכרוז עבור הגנה על ההקפאה וניקוי רקמות כי תמיסות סוכרוז או גליצרול יכול לגרום resaturation קל של הרקמה24. הנפיחות הקלה שנוצרת כתוצאה מכך יכולה להרוס שלוחות תאיות קבועות וציטונומים הנודדים בין תאים ובין רקמות. הדבר ניכר כאשר השווים בין ויברטום עבה-חתך לקטעי קריוסטאט. אף על פי שעלייה בעובי הרקמה שיפרה את שימורם של ציטונים שלמים, מקטעי הקריוסטט הרוויים של סוכרוז היו באופן עקבי בשכיחות נמוכה יותר של ציטונמים הניתנים לזיהוי.
אופטימיזציה של פרוטוקול זה גילתה כי מקטעים בעובי 100 מיקרומטר היו הטובים ביותר להבטחת שימור של ציטונומים שלמים. מקטעים דקים יותר משמשים בדרך כלל להדמיה מכיוון שרוב המיקרוסקופים הקונפוקליים מסוגלים רק להדמיה ברזולוציה מספקת כדי לדמיין הרחבות תאיות לעומק של כ-20-40 מיקרומטר מבלי לנקות25. עם זאת, הכוחות המכניים והעיוות המופעלים על תאים עובריים מהלהב תוך חיתוך חלקים דקים הורסים ציטונמים. מקטעים עבים יותר מאפשרים שטח עומק גדול יותר בתוך המקטע תוך שמירה על הרחבות שלמות בתוך הרקמה. בנוסף, השימוש בחתכים עבים יותר מאפשר טיפול קל כדי למנוע קיפול או אבזם מוגזמים של חלקי הרקמה.
פרוטוקול זה הותאם לשימור מרבי של ציטונמים ברקמה של עוברי עכבר E8-10.5. מניפולציה מינימלית של הרקמה לאחר הניתוק סיפקה שיפור עקבי בשימור הכולל של הציטונים. סביר להניח שתידרש אופטימיזציה נוספת כדי להתאים את הטכניקה לשלבים התפתחותיים מאוחרים יותר ולחתכי רקמות בוגרים בשל גודל מוגבר ומורכבות הרקמה. זה ידרוש חתך ואחריו צביעה חיסונית. רקמה כזו עשויה לדרוש שלבי ניקוי נוספים והתאמה של הטיפול ברקמות במהלך החתך כדי לשמר הרחבות דמויות ציטונמה. יהיה צורך לשקול שלבים נוספים אלה ולטפל בהם עבור יישומים עתידיים של פרוטוקול זה.
The authors have nothing to disclose.
התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופים המתוחזקים על ידי ליבת ההדמיה של התא והביולוגיה המולקולרית בבית החולים למחקר לילדים סנט ג’וד. זני עכברים התקבלו מ-JAX. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R35GM122546 של המכונים הלאומיים לבריאות (SKO) ועל ידי ALSAC של בית החולים למחקר לילדים סנט ג’וד.
12-well plate; Nunc Cell-Culture Treated | Thermo Scientific | 150628 (Fisher Scientific 12-565-321) | |
24-Well Plate, Round Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
60 mm dish | Corning, Falcon | 353004 (Fisher Scientific 08772F) | |
Absorbant towels (Professional Kimtech Science Kimwipes) | Kimberly-Clark KIMTECH | 34155 (Fisher Scientific 06666A) | |
Actin Red 555 ReadyProbes Reagent | Invitrogen | R37112 | |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson Immunoresearch Lab Inc | 703-546-155 | 1:1,000 working concentration |
Bead Bath 6L 230V | Lab Armor | Item #12L048 (Mfr. Model #74220-706) | set to 55 °C |
chicken anti-GFP | Aves Labs | SKU GFP-1020 | 1:250 working concentration |
CO2 chamber | plexiglass chamber connected to a CO2 emitting line. | ||
Confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | model: Leica TCS SP8 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
Dissecting scissors (Vannas Scissors) | World Precision Instruments | 14003 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11960044 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.1-2.5 µL | Eppendorf | 3123000012 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 0.5-10 µL | Eppendorf | 3123000020 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 100-1,000 µL | Eppendorf | 3123000063 | |
Eppendorf Research Plus single channel pipette, 20-200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
Feather Disposable Scalpel #10 | Fisher Scientific | Catalog No.NC9999403 | |
Fetal Bovine Serum, certified, United States | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 16000044 | |
Fisherbrand Fine Point High Precision Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Fisherbrand Labeling Tape | Fisher Scientific | 15-954 | |
Formaldehyde, 16%, methanol free, Ultra Pure EM Grade | Polysciences | 18814-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14025 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pap Pen | Vector laboratories | H-4000 | |
Leica Application Suite X (LAS X) with LIGHTNING | Leica Microsystems | Microscope software | |
L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25030081 | |
Low Melting Point Agarose- UltraPure | Invitrogen | 16520 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11140050 | |
Moria MC 17 BIS Perforated Spoon | Fine Science Tools | 1037018 | |
Mounting media (ProLong Diamond Antifade Mountant) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | P36961 | |
Mouse: B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J (ShhGFP/+) | The Jackson Laboratory | Strain #:008466 | |
Mouse: B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J (Shh-Cre) | The Jackson Laboratory | Strain #:005622 | |
Mouse: C57BL/6J (B6) | The Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
Mouse: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (Rosa26 mTmG) | The Jackson Laboratory | Strain #:007576 | |
Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 (Fisher Scientific NC9660079) | |
PBS + Ca2+ + Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 14040133 | |
Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
SHARP Precision Barrier Tips, Extra Long for P-10 and Eppendorf 10 µL | Denville Scientific | P1096-FR | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-1000 and Eppendorf 1,000, 1,250 µL | Denville Scientific | P1126 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-20 and Eppendorf 20 µL | Denville Scientific | P1121 | |
SHARP Precision Barrier Tips, For P-200 and Eppendorf 200 µL | Denville Scientific | P1122 | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
Sodium Pyruvate (100 mM) (100x) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11360070 | |
Super Glue | Gorilla | ||
SuperFrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TPP centrifuge tubes, volume 15 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91015 | |
TPP centrifuge tubes, volume 50 mL, polypropylene | TPP Techno Plastic Products | 91050 | |
Transfer pipette, polyethylene | Millipore Sigma | Z135003 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Vari-Mix Platform Rocker | Thermo Fisher Scientific | 09-047-113Q | set to 20 RPM |
Vibratome | Leica Biosytems | VT1000 S |