Fixatie van embryonaal muisweefsel voor cytoneme-analyse

Dit protocol volgt de goedgekeurde richtlijnen voor dierverzorging van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en het St. Jude Children’s Research Hospital. Alle stammen werden vijf generaties teruggekruist naar de C57BL/6J stam. 1. Embryo-isolatie en hele mount-kleuring Fok 6 weken oude vrouwtjes en controleer op de aanwezigheid van vaginale plug. Euthanaseer de zwangere moeder door CO 2-inademing in een CO2-kamer gevolgd door cervicale dislocatie volgens de AVMA-richtlijnen18. Maak een Y-incisie in de peritoneale holte met behulp van een ontleedschaar en tang. Snijd de baarmoeder met de E9.5-embryo’s weg volgens goedgekeurde institutionele richtlijnen. Ontleed de embryo’s in volledig groeimedium (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, aangevuld met niet-essentiële aminozuren, Na-pyruvaat, L-glutamine en 10% foetaal runderserum). Gebruik een tang om de dooierzak, placenta en omliggende membranen te verwijderen.OPMERKING: Bewaar indien nodig elke dooierzak voor embryogenotypering. Spoel de geïsoleerde embryo’s in Hank’s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) om eventueel achtergebleven vruchtwater en bloed te verwijderen. Bereid het fixatief voor. Voeg paraformaldehyde (PFA) toe aan HBSS voor een uiteindelijke werkconcentratie van 4% PFA.LET OP: PFA is een giftige chemische stof, dus inademing of directe blootstelling van de huid moet worden vermeden. Bereiding van de fixatieve oplossing wordt uitgevoerd onder een zuurkap met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen van handschoenen en een laboratoriumjas. Voeg 1 ml fixatief toe aan elk putje van een 24-wellsplaat en plaats elk embryo in een individuele put. Incubeer de embryo’s in fixatief gedurende 45 minuten met zachte agitatie op een rocker.OPMERKING: Kritisch: Alle wasbeurten en incubaties moeten worden gedaan met zachte agitatie (maximaal 20 RPM) op een rocker of cirkelvormige shaker, omdat abrupte hantering of beweging van de embryo’s de vaste cytonemen zal vernietigen. Gebruik een pipet om alle oplossingen voorzichtig te verwijderen. Verwijder het fixeermiddel en was de embryo’s 3 x 30 min in Fosfaat-Buffered Saline (PBS) met Ca2+ en Mg2+ met toegevoegde 0,1% Triton. Incubeer na het wassen de embryo’s in blokoplossing (PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Triton en 5% geitenserum) met zachte agitatie. Blok 2 x 1 uur. Voer na de tweede blokkerende incubatie een snelle spoeling van de embryo’s uit met behulp van verse blokkeringsoplossing. Bereid tijdens de tweede blokkeringsstap de primaire antilichaamoplossing11 voor. Verdun de antilichamen tot de geoptimaliseerde concentratie in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum.OPMERKING: Voor een verbeterde visualisatie van membraan-GFP kan kip anti-GFP (1:250) worden gebruikt. Verwijder de blokkerende oplossing en voeg 1 ml primaire antilichaamoplossing toe aan elke put. Incubeer bij 4 °C met zachte rotatie gedurende 3 dagen. Na de primaire antilichaamincubatie wast u de embryo’s 5 x 1 uur bij 20 RPM op een rocker in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum. Bereid de secundaire antilichaamoplossing met behulp van F(ab’)2 fragment secondaries bij een verdunning van 1:1.000 in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum.OPMERKING: Het gebruik van F(ab’)2-fragmenten verbetert de penetratie van antilichamen in het monster aanzienlijk. Voeg 1 ml secundaire antilichaamoplossing toe aan elk putje. Incubeer met zacht schommelen bij 4 °C in het donker gedurende 3 dagen.OPMERKING: Belangrijk: Minimaliseer vanaf dit punt de blootstelling van embryo’s aan direct licht. Optioneel: Om bacteriegroei te voorkomen, voegt u 0,2% natriumazide toe aan de secundaire antilichaamoplossing. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing en was de embryo’s 3 x 30 min in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum. Als u geen actinekleuring met falloïdine of andere actinekleurstoffen uitvoert, voeg dan na de eerste wasbeurt 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe aan PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum en incubeer gedurende 1 uur, gevolgd door 3 x 30 minuten wasbeurten zoals hierboven beschreven.OPMERKING: Op dit punt kunnen de embryo’s ‘s nachts bij 4 °C in PBS of HBSS in het donker worden bewaard tot de inbeddingsstap de volgende dag. Het wordt echter aanbevolen dat embryo’s onmiddellijk worden ingebed en gesneden. 2. Embryo-inbedding, sectie en montage Bereid een 4% w/v Low Melting Point (LMP) agarose oplossing opgelost in HBSS of PBS met Ca2+ en Mg2+ tot een eindvolume van ~3 ml per embryo. Voeg het juiste gewicht van LMP agarose toe aan HBSS of PBS met Ca2+ en Mg2+ en magnetron totdat de LMP agarose is opgelost.OPMERKING: Zodra de LMP agarose is opgelost, bewaart u de oplossing in een kralenbad, incubator of waterbad dat is ingesteld op 55 °C om te voorkomen dat de LMP agarose-oplossing stolt. Gebruik een 12-well plaat als de insluitvorm voor embryo’s. Plaats de 12-well plaat in het 55 °C kralenbad. Voeg 2,5-3 ml 4% LMP agarose toe aan elke put die een embryo zal bevatten.OPMERKING: Hoewel andere mallen kunnen worden gebruikt, zijn 12-well plaatvolumes optimaal voor het voorbereiden van het agarose-blok in latere stadia voor secties. Breng de embryo’s met een geperforeerde lepel over in individuele putten met 4% LMP agarose-oplossing (figuur 1A). Breng de 12-well plaat van het kralenbad over naar een benchtop. Gebruik pipetpunten om het embryo voorzichtig in te bedden en te oriënteren, zodat het gecentreerd is in de oplossing. Zodra de embryo’s zijn georiënteerd, plaatst u de plaat gedurende 10 minuten op -20 °C om een snelle stolling van het blok mogelijk te maken.KRITISCH: Zorg ervoor dat het embryo in het midden van het blok wordt geplaatst. Embryo’s die naar de bodem zinken of te dicht bij de rand van de schimmel staan, zullen waarschijnlijk tijdens het doorsnijden uit het agarose-blok worden losgemaakt. Verwijder het hele agaroseblok uit de put met behulp van een scalpel en snijd een rechthoekig blok rond het embryo waardoor ~ 0,3 cm blok aan elke kant achterblijft. Laat extra lengte toe langs het caudale uiteinde van het embryo. Wanneer het op het vibratoom wordt gemonteerd, richt u het embryo rechtop in het bovenste gedeelte van het blok (figuur 1B). Breng een strook tape aan op de monsterhouder van het vibratoom en secondelijm het agaroseblok op de tape, zo georiënteerd dat het blad axiale delen van het embryo genereert in een anterieure (craniale) naar posterieure sequentie. Vul de vibratomekamer met koude HBSS om ervoor te zorgen dat het monster volledig is ondergedompeld en omring de kamer vervolgens met ijs. Stel de vibratomsnelheid in op 0,2 mm/s en de frequentie tussen 5 en 7 (50-70 Hz) met een snijdikte ingesteld op 100 μm. Voer seriële axiale sectie van het embryo uit.OPMERKING: Gebruik een lage snelheid voor secties. Als de snijsnelheid wordt verhoogd tot boven 0,25 mm/s, kan de doorsnede het embryo scheuren of het embryo uit het blok losmaken. Gebruik tijdens de sectieserie een tang om afzonderlijke secties voorzichtig over te brengen naar een afzonderlijke schotel van 60 mm gevuld met HBSS. Gebruik een tang om het blok te grijpen, niet het weefsel, om weefselschade en vernietiging van cytonemen te voorkomen.OPMERKING: Weefselsecties moeten binnen het agaroseblok blijven. Als het weefsel uit het blok in de vibratoomkamer valt, breng dan voorzichtig over door het gedeelte eruit te tillen. Pak of knijp het weefsel niet vast. KRITIEK: Elke vouwing van weefselsecties of abrupte behandeling zal vaste cytonemen in de weefselsecties vernietigen. Als u geen F-actinekleuring uitvoert, gaat u verder met stap 2.10. Om F-actinekleuring uit te voeren, verwijdert u HBSS en incubeert u secties gedurende 40 minuten met Actin-Red en DAPI-oplossing verdund in PBS met Ca2+ en Mg2+, 0,1% Tween-20 en 5% geitenserum bij kamertemperatuur. Was secties 3 x 20 min in PBS met Ca2+ en Mg2+ en 0,1% Tween-20. Teken met behulp van een hydrofobe markeerpen een hydrofobe barrière rond de randen van een geladen microscoopglaasje en voeg een klein volume HBSS toe om het gebied te vullen. Gebruik een tang of een geperforeerde lepel om secties naar de dia over te brengen.OPMERKING: Alle weefselsecties die niet in agarose zijn ingepakt, kunnen via een transferpipet worden overgebracht. Verwijder overtollig agarose blok met behulp van een tang. Zodra alle secties naar de dia zijn overgebracht, verwijdert u overtollige vloeistof via pipetteren en de hoek van een absorberende handdoek en voegt u vervolgens enkele druppels montagemedium toe aan de dia. Gebruik voldoende bevestigingsmedium om het hele gebied van de afdekkingslip te bedekken wanneer het is uitgehard. Monteer de coverslip door deze voorzichtig op de glijbaan te plaatsen.OPMERKING: Vermijd het uitoefenen van druk of storende coverslip totdat het montagemedium is uitgehard. 3. Beeldvorming Voer beeldvorming van weefselsecties uit op een confocale of hogere resolutie microscoop11. Analyseer minimaal drie embryo’s per genotype.OPMERKING: Beelden van weefselsecties werden verkregen met behulp van een TCS SP8 STED 3x confocale microscoop, gevolgd door LIGHTNING-deconvolutie.