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Neuroscience

ポリ(I:C)を用いた妊娠中期の母体免疫活性化の再現モデルの生成による子孫の感受性と回復力の研究

Published: August 17, 2022
doi:
10.3791/64095
,
1Center for Neuroscience,UC Davis

Summary

母体感染は神経発達障害の危険因子です。母体免疫活性化(MIA)のマウスモデルは、感染が脳の発達と機能に与える影響を解明する可能性があります。ここでは、MIAにさらされた確実に回復力があり感受性のある子孫を産出するための一般的なガイドラインと手順が提供されています。

Abstract

妊娠中の母親の免疫活性化(MIA)は、子孫の神経発達障害および神経精神障害のリスクの増加と一貫して関連しています。MIAの動物モデルは、因果関係をテストし、メカニズムを調査し、これらの障害の診断と治療法を開発するために使用されます。広く使用されているにもかかわらず、多くのMIAモデルは再現性の欠如に苦しんでおり、ほとんどすべてがこの危険因子の2つの重要な側面を無視しています:(i)多くの子孫はMIAに対して回復力があり、(ii)感受性の子孫は表現型の異なる組み合わせを示す可能性があります。再現性を高め、MIAに対する感受性と回復力の両方をモデル化するために、妊娠前の雌マウスのベースライン免疫反応性(BIR)を使用して、どの妊娠が回復力のある子孫またはMIAへの曝露後に定義された行動的および分子的異常を持つ子孫をもたらすかを予測します。ここでは、妊娠12.5日目に二本鎖RNA(dsRNA)ウイルス模倣ポリ(I:C)の腹腔内(i.p.)注射 を介して MIAを誘導する詳細な方法が提供される。この方法は、ダムで急性炎症反応を誘発し、その結果、マウスの脳発達に混乱が生じ、ヒトの精神障害および神経発達障害(NDD)の同様の影響を受けるドメインにマッピングされます。

Introduction

疫学的証拠は、母親の感染を、統合失調症(SZ)および自閉症スペクトラム障害(ASD)を含む精神医学的およびNDDのリスク増加に関連付けています1,2,3,4,5,6,7。MIAマウスモデルは、これらの障害の病因におけるMIAの因果関係と機構的役割をテストし、分子バイオマーカーを特定し、診断ツールと治療ツールの両方を開発するために開発されました4,6。このモデルの有用性と人気の高まりにもかかわらず、フィールド内のMIA誘導プロトコルにはかなりのばらつきがあり、研究間で結果を比較し、調査結果を再現することは困難です8,9。さらに、モデルのほとんどの反復は、MIAの2つの重要な翻訳的側面を調査していません:(i)多くの子孫はMIAに対して回復力があり、(ii)感受性子孫は表現型の異なる組み合わせを示す可能性があります8。

再現可能なMIAモデルを生成するために、研究者はダムで誘発されたMIAの大きさの少なくとも1つの定量的測定値を報告する必要があります。妊娠中にMIAを誘導するために、私たちの研究室では、ポリイノシティックを模倣した二本鎖RNAウイルスであるポリシチジル酸[ポリ(I:C)]の腹腔内(i.p.)注射を行います。 Poly(I:C)は、toll様受容体3(TLR3)10によって認識されるため、インフルエンザウイルスと同様の免疫カスケードを誘導します。その結果、ポリ(I:C)は急性期応答を活性化し、炎症誘発性サイトカインの急速な上昇をもたらします8,11,12。以前の研究では、MIA11,12,13の結果として、インターロイキン-6(IL-6)を含む炎症誘発性サイトカインの上昇が子孫に行動異常および神経病理学を引き起こすために必要であることが実証されています。したがって、ポリ(I:C)注射後2.5時間のピーク時に収集された母体血清中のIL-6のレベルは、フィールド内の検査室間で結果を比較するために使用できるMIAの説得力のある定量的尺度です。

単一の誘導プロトコル8,14で回復力と感受性の翻訳的に不可欠な要素に対処するMIAモデルを生成するために、研究者は典型的な誘導アプローチと妊娠前のダムのベースライン免疫反応性(BIR)の特性評価を組み合わせることができます8。最近、処女の雌C57BL/6マウスが、妊娠前のポリ(I:C)への低線量曝露に対して広範囲のIL-6応答を示すことが発見されました8。感受性の高い子孫を産み続けるのはこれらの雌のサブセットのみであり、BIRとポリ(I:C)用量8の組み合わせによって決定される特定の大きさの免疫活性化でのみ発生します。MIAは逆Uパターンで表現型を誘導します。子孫は、ダムが中程度の免疫反応性であり、母親の炎症の大きさが臨界範囲8に達するが、それを超えない場合に、最大の行動的および分子的異常を示します。ここでは、ポリ(I:C)の妊娠中期注射の結果として、異なる行動表現型を持つ回復力のある子孫と感受性のある子孫の両方を確実に作成する方法の詳細な方法が提供されています。

Protocol

すべてのプロトコルは、カリフォルニア大学デービス校の施設動物管理および使用委員会(IACUC)の承認の下で実行されます。 1.動物の準備 動物を取得するときは、最大の再現性を確保するために、次のパラメーターを一貫してください。ベンダーとベンダーの場所:以前に報告されたように、野生型C57BL / 6Jマウスは、ベンダーに応じて同じ用量の…

Representative Results

E12.5で30 mg / kgのポリ(I:C)に曝露されたすべての動物が、一貫した行動異常を伴う子孫を産むわけではありません8,31。30 mg/kgと40 mg/kgのポリ(I:C)はどちらも、活動レベルの低下、低体温反応、体重減少など、ダムで確実に病気行動を引き起こし、IL-6の大幅な上昇を引き起こしますが、MIAに曝露された同腹仔のサブセットのみが、人間の精神医学的およ?…

Discussion

母体感染は、ヒトおよびげっ歯類および非ヒト霊長類の両方の脳発達の過程を変える4,5,7。ここでは、ポリ(I:C)を用いて妊娠中期の時点でマウスにMIAを誘導する手順を概説する。この方法には、妊娠前のBIRの評価が組み込まれているため、再現性が向上し、MIA8に対する子孫の回復力と感受性につながるメ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

マウスMIAモデルの変動性に対処することに固執してくれたMyka Estes博士と、ここで説明するメソッドプロトコルの開発につながったEstesら8 のすべての貢献者に感謝します。ここで報告された研究は、NIMH 2P50 MH106438-06(A.K.M.)およびNIMH T32MH112507(K.P.)によってサポートされました。

Materials

0.9% NaCl physiological endotoxin free saline Sigma-Aldrich 7647-14-5 Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish Thomas Scientific 1219Z45 Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels Bio-rad 4561084 Optional
Ancare Nestlets Fisher Scientific NC9365966 Optional
anti-β-tubulin Millipore MAB3408 Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I Bio-rad 171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate Bio-rad 171304070M
Bovine Serum Albumin ThermoFisher 23209 Optional
Centrifuge Eppendorf 5810R Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle Spectrum 552-58457-083
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779-10G Optional
Environmental enrichment Bio-serv K3327 and K3322 Optional
Ethovision Noldus Ethovision Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies Li-cor 925-32213 and 925-68072 Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed) Various vendors Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS ThermoFisher 14060040 Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Invivogen #tlrl-pic-5 Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer AIMS 1000 Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software Licor 5.2 Optional
Laemmli buffer Bio-rad 1610737EDU Optional
Luminex200 ThermoFisher APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube Sarstedt 16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Sigma-Aldrich #P0913 Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A AbCam ab76063 Optional
monoclonal anti-STAT3 Cell signaling 12640S Optional
Observer Noldus Observer Optional
Odyssey blocking buffer (TBS) Li-cor 927-50003 Optional
Odyssey CLx imaging system Li-cor 9140 Optional
Omnipure PBS Millipore 65054L Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23227 Optional
polyclonal anti_TH Pel-Freez P4101-150 Optional
PVDF membrane Bio-rad 162-0177 Optional
Qsonica Sonicator Q500 Fisher Scientific 15-338-282 Optional
Quick blood stopper Petco 17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile USA Scientific 1615-5500
Soldering stand Amazon B08Y12QC73 Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds Bio-serv S5137-1 Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set, Bio-rad 171G5007M
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Optional
Tween 20 Bio-rad 23209 Optional
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References

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Prendergast, K., McAllister, A. K. Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring. J. Vis. Exp. (186), e64095, doi:10.3791/64095 (2022).
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