Erstellung eines reproduzierbaren Modells der mütterlichen Immunaktivierung in der Mitte der Schwangerschaft unter Verwendung von Poly(I:C) zur Untersuchung der Suszeptibilität und Resilienz bei Nachkommen
Summary
Eine Infektion der Mutter ist ein Risikofaktor für neurologische Entwicklungsstörungen. Mausmodelle der mütterlichen Immunaktivierung (MIA) können die Auswirkungen der Infektion auf die Entwicklung und Funktion des Gehirns aufklären. Hier werden allgemeine Richtlinien und ein Verfahren bereitgestellt, um zuverlässig belastbare und anfällige Nachkommen zu erzeugen, die MIA ausgesetzt sind.
Abstract
Die mütterliche Immunaktivierung (MIA) während der Schwangerschaft ist durchweg mit einem erhöhten Risiko für neurologische Entwicklungsstörungen und neuropsychiatrische Störungen bei den Nachkommen verbunden. Tiermodelle der MIA werden verwendet, um die Kausalität zu testen, Mechanismen zu untersuchen und Diagnosen und Behandlungen für diese Erkrankungen zu entwickeln. Trotz ihrer weit verbreiteten Verwendung leiden viele MIA-Modelle unter mangelnder Reproduzierbarkeit und ignorieren fast alle zwei wichtige Aspekte dieses Risikofaktors: (i) viele Nachkommen sind resistent gegen MIA, und (ii) anfällige Nachkommen können unterschiedliche Kombinationen von Phänotypen aufweisen. Um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen und sowohl die Anfälligkeit als auch die Resilienz gegenüber MIA zu modellieren, wird die Baseline-Immunreaktivität (BIR) weiblicher Mäuse vor der Schwangerschaft verwendet, um vorherzusagen, welche Schwangerschaften entweder zu resistenten Nachkommen oder Nachkommen mit definierten Verhaltens- und molekularen Anomalien nach Exposition gegenüber MIA führen werden. Hier wird eine detaillierte Methode zur Induktion von MIA durch intraperitoneale (i.p.) Injektion der doppelsträngigen RNA (dsRNA) viralen Mimik Poly(I:C) nach 12,5 Tagen der Schwangerschaft bereitgestellt. Diese Methode induziert eine akute Entzündungsreaktion im Muttertier, die bei Mäusen zu Störungen der Gehirnentwicklung führt, die sich auf ähnlich betroffene Domänen bei menschlichen psychiatrischen und neurologischen Entwicklungsstörungen (NDDs) abbilden.
Introduction
Epidemiologische Beweise verbinden eine Infektion der Mutter mit einem erhöhten Risiko für psychiatrische und NDDs, einschließlich Schizophrenie (SZ) und Autismus-Spektrum-Störung (ASD)1,2,3,4,5,6,7. Das MIA-Mausmodell wurde entwickelt, um die Kausalität und die mechanistische Rolle von MIA in der Ätiologie dieser Erkrankungen zu testen, molekulare Biomarker zu identifizieren und sowohl diagnostische als auch therapeutische Werkzeuge zu entwickeln 4,6. Trotz der Nützlichkeit dieses Modells und seiner zunehmenden Popularität gibt es eine beträchtliche Variabilität der MIA-Induktionsprotokolle innerhalb des Feldes, was es schwierig macht, die Ergebnisse zwischen Studien zu vergleichen und die Ergebnisse zu replizieren 8,9. Darüber hinaus untersuchen die meisten Iterationen des Modells zwei wichtige translationale Aspekte von MIA nicht: (i) viele Nachkommen sind resistent gegen MIA, und (ii) anfällige Nachkommen können unterschiedliche Kombinationen von Phänotypen aufweisen8.
Um ein reproduzierbares MIA-Modell zu erstellen, sollten die Forscher mindestens ein quantitatives Maß für das Ausmaß der in Staudämmen induzierten MIA angeben. Um MIA während der Schwangerschaft zu induzieren, führt unser Labor intraperitoneale (i.p.) Injektionen der doppelsträngigen RNA durch, die polyinositisch nachahmt: Polycytidilsäure [Poly(I:C)]. Poly(I:C) induziert eine Immunkaskade ähnlich wie Influenzaviren, wie sie vom Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3)10 erkannt wird. Infolgedessen aktiviert Poly(I:C) die Akute-Phase-Reaktion, die zu einer schnellen Erhöhung der proinflammatorischen Zytokine 8,11,12 führt. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Erhöhung von proinflammatorischen Zytokinen, einschließlich Interleukin-6 (IL-6), notwendig ist, um Verhaltensanomalien und Neuropathologie bei Nachkommen als Folge von MIA11,12,13 hervorzurufen. Daher ist der IL-6-Spiegel im mütterlichen Serum, der während seines Höhepunkts 2,5 h nach der Poly(I:C)-Injektion gesammelt wurde, ein überzeugendes quantitatives Maß für MIA, das verwendet werden kann, um die Ergebnisse zwischen Laboratorien innerhalb des Feldes zu vergleichen.
Um ein MIA-Modell zu generieren, das die translational wesentlichen Elemente der Resilienz und Suszeptibilität mit einem einzigen Induktionsprotokoll 8,14 adressiert, können Forscher typische Induktionsansätze mit der Charakterisierung der Basis-Immunreaktivität (BIR) der Mutter vor der Schwangerschaft kombinieren 8. Kürzlich wurde entdeckt, dass jungfräuliche weibliche C57BL/6-Mäuse eine breite Palette von IL-6-Reaktionen auf eine niedrig dosierte Exposition gegenüber Poly(I:C) vor der Schwangerschaft zeigen8. Es ist nur eine Untergruppe dieser Weibchen, die anfällige Nachkommen hervorbringt, und nur in bestimmten Größenordnungen der Immunaktivierung, wie sie durch die Kombination von BIR und Poly(I:C)-Dosis8 vorgegeben wird. MIA induziert Phänotypen in einem umgekehrten U-Muster; Nachkommen zeigen die größten Verhaltens- und molekularen Aberrationen, wenn Muttertiere mäßig immunreaktiv sind und das Ausmaß der mütterlichen Entzündung einen kritischen Bereich erreicht, aber nicht überschreitet8. Hier wird eine detaillierte Methode vorgestellt, wie sowohl belastbare als auch anfällige Nachkommen mit divergierenden Verhaltensphänotypen als Folge der Injektion von Poly(I:C) in der Mitte der Schwangerschaft zuverlässig erzeugt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Infektion der Mutter verändert den Verlauf der Gehirnentwicklung beim Menschen und sowohl bei Nagetieren als auch bei nichtmenschlichen Primaten 4,5,7. Hier wird ein Verfahren zur Induktion von MIA in Mäusen zu einem Zeitpunkt in der Mitte der Schwangerschaft unter Verwendung von Poly(I:C) skizziert. Diese Methode beinhaltet die Bewertung von BIR vor der Schwangerschaft, was die Reproduzierbarkeit erhöht und die Möglich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Myka Estes für ihre Beharrlichkeit bei der Behandlung der Variabilität im MIA-Modell der Maus und allen Mitwirkenden in Estes et al.8 für ihre Arbeit, die zur Entwicklung des hier beschriebenen Methodenprotokolls geführt hat. Die hier berichtete Forschung wurde von NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) und NIMH T32MH112507 (K.P.) unterstützt.
Materials
| 0.9% NaCl physiological endotoxin free saline | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Control and vehicle for Poly(I:C) |
| 35mm petri dish | Thomas Scientific | 1219Z45 | Used to hold oil during tail bleed |
| 7.5% TGX gels | Bio-rad | 4561084 | Optional |
| Ancare Nestlets | Fisher Scientific | NC9365966 | Optional |
| anti-β-tubulin | Millipore | MAB3408 | Optional |
| Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I | Bio-rad | 171I50001 | |
| Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate | Bio-rad | 171304070M | |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher | 23209 | Optional |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Optional |
| Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle | Spectrum | 552-58457-083 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779-10G | Optional |
| Environmental enrichment | Bio-serv | K3327 and K3322 | Optional |
| Ethovision | Noldus | Ethovision | Optional |
| Fluorsecent-tagged seondary ntibodies | Li-cor | 925-32213 and 925-68072 | Optional |
| Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed) | Various vendors | Use to lubricate tail during tail bleeds | |
| HBSS | ThermoFisher | 14060040 | Optional |
| High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid | Invivogen | #tlrl-pic-5 | Used to establish females' BIR |
| Humane Mouse Restrainer | AIMS | 1000 | Used to restrain mouse during tail bleeds |
| Image Studio Software | Licor | 5.2 | Optional |
| Laemmli buffer | Bio-rad | 1610737EDU | Optional |
| Luminex200 | ThermoFisher | APX10031 | |
| Microvette CB300 300μl Serum capillary tube | Sarstedt | 16.440.100 | |
| Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid | Sigma-Aldrich | #P0913 | Gestational induction of MIA |
| monoclonal anti-MEF2A | AbCam | ab76063 | Optional |
| monoclonal anti-STAT3 | Cell signaling | 12640S | Optional |
| Observer | Noldus | Observer | Optional |
| Odyssey blocking buffer (TBS) | Li-cor | 927-50003 | Optional |
| Odyssey CLx imaging system | Li-cor | 9140 | Optional |
| Omnipure PBS | Millipore | 65054L | Optional |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | Optional |
| polyclonal anti_TH | Pel-Freez | P4101-150 | Optional |
| PVDF membrane | Bio-rad | 162-0177 | Optional |
| Qsonica Sonicator Q500 | Fisher Scientific | 15-338-282 | Optional |
| Quick blood stopper | Petco | 17140 | |
| Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Soldering stand | Amazon | B08Y12QC73 | Used to hold capillary tube during tail bleeds |
| Sunflower seeds | Bio-serv | S5137-1 | Use to increase breeding efficiency |
| The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set, | Bio-rad | 171G5007M | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | Optional |
| Tween 20 | Bio-rad | 23209 | Optional |
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