Summary

Gerando um Modelo Reprodutível de Ativação Imune Materna de Gestações Médias usando Poly(I:C) para Estudo de Suscetibilidade e Resiliência em Descendentes

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

A infecção materna é um fator de risco para distúrbios do neurodesenvolvimento. Modelos de camundongos de ativação imune materna (MIA) podem elucidar o impacto da infecção no desenvolvimento e função cerebral. Aqui, diretrizes gerais e um procedimento são fornecidos para produzir descendentes confiáveis e suscetíveis expostos ao MIA.

Abstract

A ativação imune materna (MIA) durante a gravidez está consistentemente ligada ao aumento do risco de distúrbios neurodesenvolvimentais e neuropsiquiátricos na prole. Modelos animais de MIA são usados para testar a causalidade, investigar mecanismos e desenvolver diagnósticos e tratamentos para esses distúrbios. Apesar de seu uso generalizado, muitos modelos de MIA sofrem de falta de reprodutibilidade e quase todos ignoram dois aspectos importantes desse fator de risco: (i) muitos descendentes são resilientes ao MIA e (ii) descendentes suscetíveis podem exibir combinações distintas de fenótipos. Para aumentar a reprodutibilidade e modelar a suscetibilidade e a resiliência à AIM, a imunorreatividade basal (BIR) de camundongos fêmeas antes da gravidez é usada para prever quais gestações resultarão em descendentes resilientes ou descendentes com anormalidades comportamentais e moleculares definidas após a exposição à MIA. Aqui, um método detalhado de indução de MIA via injeção intraperitoneal (i.p.) do RNA de fita dupla (dsRNA) viral mimético poli(I:C) aos 12,5 dias de gestação é fornecido. Este método induz uma resposta inflamatória aguda na barragem, o que resulta em perturbações no desenvolvimento do cérebro em camundongos que mapeiam domínios de impacto semelhante em transtornos psiquiátricos e do neurodesenvolvimento (NDDs) humanos.

Introduction

Evidências epidemiológicas ligam a infecção materna ao aumento do risco de doenças psiquiátricas e DDNs, incluindo esquizofrenia (SZ) e transtorno do espectro autista (TEA)1,2,3,4,5,6,7. O modelo de camundongos com AIM foi desenvolvido para testar a causalidade e o papel mecanicista da AIM na etiologia desses distúrbios, bem como para identificar biomarcadores moleculares e desenvolver ferramentas diagnósticas e terapêuticas 4,6. Apesar da utilidade desse modelo e de sua crescente popularidade, há uma variabilidade considerável nos protocolos de indução de AIM dentro do campo, dificultando a comparação dos resultados entre os estudos e a replicação dos achados 8,9. Além disso, a maioria das iterações do modelo não investiga dois importantes aspectos translacionais da AIM: (i) muitos descendentes são resilientes ao MIA e (ii) descendentes suscetíveis podem exibir combinações distintas de fenótipos8.

Para gerar um modelo de MIA reprodutível, os pesquisadores devem relatar pelo menos uma medida quantitativa da magnitude da MIA induzida em barragens. Para induzir a AIM durante a gestação, nosso laboratório realiza injeções intraperitoneais (i.p.) do RNA de fita dupla viral mimetizado poliinosítico: ácido policitidílico [poli(I:C)]. Poly(I:C) induz uma cascata imune semelhante aos vírus influenza, pois é reconhecida pelo receptor toll-like 3 (TLR3)10. Como resultado, a poli(I:C) ativa a resposta de fase aguda que resulta em rápida elevação das citocinas pró-inflamatórias 8,11,12. Estudos prévios demonstraram que a elevação de citocinas pró-inflamatórias, incluindo a interleucina-6 (IL-6), é necessária para produzir anormalidades comportamentais e neuropatologia na prole como resultado da AIM11,12,13. Assim, o nível de IL-6 no soro materno coletado durante seu pico em 2,5 h após a injeção de poli(I:C) é uma medida quantitativa convincente de MIA que pode ser usada para comparar resultados entre laboratórios dentro do campo.

A fim de gerar um modelo de MIA que aborde os elementos translacionalmente essenciais de resiliência e suscetibilidade com um único protocolo de indução 8,14, os pesquisadores podem combinar abordagens típicas de indução com a caracterização da imunorreatividade basal da barragem (BIR) antes da gravidez8. Recentemente, descobriu-se que camundongos C57BL/6 fêmeas virgens mostram uma ampla gama de respostas de IL-6 a uma exposição de baixa dose a poli(I:C) antes da gravidez8. É apenas um subconjunto dessas fêmeas que passam a produzir descendentes suscetíveis, e apenas em certas magnitudes de ativação imunológica, conforme ditado pela combinação de BIR e dose poli(I:C)8. A MIA induz fenótipos em um padrão U invertido; os descendentes apresentam as maiores aberrações comportamentais e moleculares quando as mães são moderadamente imunorreativas, e a magnitude da inflamação materna atinge, mas não excede, uma faixa crítica8. Aqui, um método detalhado de como criar de forma confiável descendentes resilientes e suscetíveis com fenótipos comportamentais divergentes como resultado da injeção gestacional média de poli(I:C) é fornecido.

Protocol

Todos os protocolos são realizados sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia-Davis (IACUC). 1. Preparação animal Ao adquirir animais, mantenha os seguintes parâmetros consistentes para garantir a máxima reprodutibilidade.Local do fornecedor e do fornecedor: como relatado anteriormente, os camundongos do tipo selvagem C57BL/6J exibem respostas diferentes à mesma dose de poli(I:C), dependendo do…

Representative Results

Nem todos os animais expostos a 30 mg/kg de poli(I:C) em E12.5 produzem descendentes com anormalidades comportamentais consistentes 8,31. Embora tanto 30 mg/kg quanto 40 mg/kg de poli(I:C) produzam de forma confiável comportamentos de doença em barragens, incluindo diminuição dos níveis de atividade, respostas hipotérmicas e perda de peso, e também causem elevações significativas na IL-6, apenas um subconjunto de ninhadas expostas à IAM continuará a de…

Discussion

A infecção materna altera o curso do desenvolvimento cerebral em humanos e em roedores e primatas não humanos 4,5,7. Aqui, um procedimento para induzir MIA em camundongos em um ponto de tempo médio gestacional usando poli(I:C) é descrito. Esse método incorpora a avaliação da BIR antes da gravidez, o que aumenta a reprodutibilidade e oferece a chance de investigar mecanicamente os mecanismos que levam à resiliência e su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos à Dra. Myka Estes por sua persistência em abordar a variabilidade no modelo MIA de camundongos e a todos os colaboradores em Estes et al.8 por seu trabalho que levou ao desenvolvimento do protocolo de métodos aqui descrito. A pesquisa aqui relatada foi apoiada pelo NIMH 2P50 MH106438-06 (A.K.M.) e NIMH T32MH112507 (K.P.).

Materials

0.9% NaCl physiological endotoxin free saline Sigma-Aldrich 7647-14-5 Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish Thomas Scientific 1219Z45 Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels Bio-rad 4561084 Optional
Ancare Nestlets Fisher Scientific NC9365966 Optional
anti-β-tubulin Millipore MAB3408 Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I Bio-rad 171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate Bio-rad 171304070M
Bovine Serum Albumin ThermoFisher 23209 Optional
Centrifuge Eppendorf 5810R Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle Spectrum 552-58457-083
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779-10G Optional
Environmental enrichment Bio-serv K3327 and K3322 Optional
Ethovision Noldus Ethovision Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies Li-cor 925-32213 and 925-68072 Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed) Various vendors Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS ThermoFisher 14060040 Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Invivogen #tlrl-pic-5 Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer AIMS 1000 Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software Licor 5.2 Optional
Laemmli buffer Bio-rad 1610737EDU Optional
Luminex200 ThermoFisher APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube Sarstedt 16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid Sigma-Aldrich #P0913 Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A AbCam ab76063 Optional
monoclonal anti-STAT3 Cell signaling 12640S Optional
Observer Noldus Observer Optional
Odyssey blocking buffer (TBS) Li-cor 927-50003 Optional
Odyssey CLx imaging system Li-cor 9140 Optional
Omnipure PBS Millipore 65054L Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher 23227 Optional
polyclonal anti_TH Pel-Freez P4101-150 Optional
PVDF membrane Bio-rad 162-0177 Optional
Qsonica Sonicator Q500 Fisher Scientific 15-338-282 Optional
Quick blood stopper Petco 17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile USA Scientific 1615-5500
Soldering stand Amazon B08Y12QC73 Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds Bio-serv S5137-1 Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set, Bio-rad 171G5007M
Tris base Fisher Scientific BP152-1 Optional
Tween 20 Bio-rad 23209 Optional

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Prendergast, K., McAllister, A. K. Generating a Reproducible Model of Mid-Gestational Maternal Immune Activation using Poly(I:C) to Study Susceptibility and Resilience in Offspring. J. Vis. Exp. (186), e64095, doi:10.3791/64095 (2022).

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